核酸探針的種類 1.按來源及性質(zhì)劃分 可將核酸探針分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類。
作為診斷試劑,較常使用的是基因組DNA探針和cDNA探針。其中,前者應(yīng)用最為廣泛,它的制備可通過酶切或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從基因組中獲得特異的DNA后將其克隆到質(zhì)粒或噬菌體載體中,隨著質(zhì)粒的復(fù)制或噬菌體的增殖而獲得大量高純度的DNA探針。
將 RNA進行反轉(zhuǎn)錄,所獲得的產(chǎn)物即為cDNA。cDNA探針適用于RNA病毒的檢測。
cDNA探針序列也可克隆到質(zhì)?;蚴删w中,以便大量制備。 將信息RNA(mRNA)標記也可作為核酸分子雜交的探針。
但由于來源極不方便,且RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶所降解,操作不便,因此應(yīng)用較少。 用人工合成的寡聚核苷酸片段做為核酸雜交探針應(yīng)用十分廣泛,可根據(jù)需要隨心所欲合成相應(yīng)的序列,可合成僅有幾十個bp的探針序列,對于檢測點突變和小段堿基的缺失或插入尤為適用 2.按標記物劃分 有放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類。
放射性標記探針用放射性同位素做為標記物。放射性同位素是最早使用,也是目前應(yīng)用最廣泛的探針標記物。
常用的同位素有32P、3H、35S。其中,以32P應(yīng)用最普遍。
放射性標記的優(yōu)點是靈敏度高,可以檢測到Pg級;缺點是易造成放射性污染,同位素半衰期短、不穩(wěn)定、成本高等。因此,放射性標記的探針不能實現(xiàn)商品化。
目前,許多實驗室都致力于發(fā)展非放射性標記的探針。 目前應(yīng)用較多的非放射性標記物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。
二者都是半抗原。生物素是一種小分子水溶性維生素,對親和素有獨特的親和力,兩者能形成穩(wěn)定的復(fù)合物,通過連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì)(如酶、熒光素等)進行檢測。
地高辛是一種類固醇半抗原分子,可利用其抗體進行免疫檢測,原理類似于生物素的檢測。地高辛標記核酸探針的檢測靈敏度可與放射性同位素標記的相當,而特異性優(yōu)于生物素標記,其應(yīng)用日趨廣泛。
雜交過程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。其基本原理就是應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì),使來源不同的DNA(或RNA)片段,按堿基互補關(guān)系形成雜交雙鏈分子(heteroduplex)。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間,也可在RNA與DNA鏈之間形成。使雙螺旋解開成為單鏈,因此,變性技術(shù)也是核酸雜交的一個環(huán)節(jié)。
雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總DNA或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測的核酸可以是提純的,也可以在細胞內(nèi)雜交,即細胞原位雜交。探針必須經(jīng)過標記,以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素,但由于同位素的安全性,近年來發(fā)展了許多非同位素標記探針的方法。
核酸探針根據(jù)核酸的性質(zhì),可分為DNA和RNA探針;根據(jù)是否使用放射性標記物的與否,可分為放射性標記探針和非放射性標記探針;根據(jù)是否存在互補鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據(jù)放射性標記物摻入情況,可分為均勻標記和末端標記探針。
下面將介紹各種類型的探針及標記方法。 分子生物研究中,最常用的探針即為雙鏈DNA探針,它廣泛應(yīng)用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。
雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。1. 切口平移法(nick translation) 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。
同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸,將放射性同位素摻入到合成新鏈中。
最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響: (a) 產(chǎn)物的比活性取決于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。
(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細純化后的DNA。
材料: 待標記的DNA。設(shè)備:高速臺式離心機,恒溫水浴鍋等。
試劑:(1)10*切口平移緩沖液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。(2)未標記的dNTP原液:除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mmol/L。
(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4單位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油,50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。
(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
(7)10mol/L NH4Ac。操作步驟:(1) 按下列配比混合:未標記的dNTP 10μl10*切口平移緩沖液 5μl待標記的DNA 1μg[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μlE.coli DNA聚合酶 4單位DAN酶 I 1μl加水至終體積 50μl(2) 置于15℃水浴60分鐘。
(3) 加入5μl EDTA終止反應(yīng)。(4) 反應(yīng)液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5mol/L, 加入兩倍體積預(yù)冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。
[注意]1、3H,32P及35S標記的dNTP都可使用于探針標記,但通常使用[α-32 P]-dNTP。2、DNA酶Ⅰ的活性不同,所得到的探針比活性也不同,DNA酶Ⅰ活性高,則所得探針比活性高,但長度比較短。
隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的量。
通常,產(chǎn)物平均長度為400-600個核苷酸。利用隨機引物進行反應(yīng)的優(yōu)點是:(1)Klenow片段沒有5'→3'外切酶活性,反應(yīng)穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。
(2)反應(yīng)時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進行反應(yīng)。(3)反應(yīng)產(chǎn)物的比活性較高,可達4*109 cpm/μg探針。
(4)隨機引物反應(yīng)還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。材料:待標記的DNA片段。
設(shè)備:高速臺式離心機,恒溫水浴鍋等。試劑:(1)隨機引物(隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA)。
(2)10*隨機標記緩沖液:900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。(3)Klenow片段。
(4)20mmol/L DTT。(5)未標記的dNTP溶液:dGTP、dCTP和dTTP溶液,各5mmol/L。
(6)[α-32 P] dATP:比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。(7)緩沖液A:50mmol/L Tris·Cl (pH7.5); 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA (pH8.0); 0.5% SDS。
操作步驟:(1) 200ng雙鏈DNA(1μl)和7.5ng隨機引物(1μl)混合后置于eppendorf管內(nèi),水浴煮沸5分鐘后,立即置于冰浴中1分鐘。(2) 與此同時,盡快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管內(nèi)混合下列化合物:20mmol/L DTT 1μl未標記的dNTP溶液 1μl10*隨機標記緩沖液 1μl[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μlddH2O 1μl(3) 將步驟(1)eppendorf管中的溶液移到步驟(2)管中。
(4) 加入5單位(約1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型離心機中以12000g離心1-2秒, 使所有溶液沉于試管底部,在室溫下保溫3-16小時。(5) 在反應(yīng)液中加入10μl緩沖液A后,將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。
同時計算放射比活性。[注意]1、引物與模板的比例應(yīng)仔細調(diào)整,當引物高于模板時,反應(yīng)產(chǎn)物比較短,但產(chǎn)物的累積較多;反之,則可獲得較長片段的探針。
2、模板DNA應(yīng)是線性的,如為超螺旋DNA,則標記效率不足50%。 用雙鏈探針雜交檢測另一個遠緣DNA時,探針序列與被檢測序列間有很多錯配。
而兩條探針互補鏈之間的配對卻十分穩(wěn)定,即形成自身的無效雜交,結(jié)果使檢測效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。
單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:(1) 以M13載體衍生序列為模板,用Klenow片段合成單鏈探針; (2) 以RNA為模板, 用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針。1. 從M13載體衍生序。
雜交過程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。
其基本原理就是應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì),使來源不同的DNA(或RNA)片段,按堿基互補關(guān)系形成雜交雙鏈分子(heteroduplex)。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間,也可在RNA與DNA鏈之間形成。
使雙螺旋解開成為單鏈,因此,變性技術(shù)也是核酸雜交的一個環(huán)節(jié)。 雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。
該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總DNA或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測的核酸可以是提純的,也可以在細胞內(nèi)雜交,即細胞原位雜交。
探針必須經(jīng)過標記,以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素,但由于同位素的安全性,近年來發(fā)展了許多非同位素標記探針的方法。
通過核酸標記技術(shù)可將細胞因子cDNA作為基因探釗檢測細胞內(nèi)細胞因子 基因組 DNA或mRNA。主要有以下幾種方法:
1.應(yīng)用同位素(或非同位素)標記的cDNA探針,檢測經(jīng)Northern blot后細胞因子mRNA水平或采用打點雜交法。
2.應(yīng)用標記cDNA探釗與細胞或組織切片進行原位雜交,然后進行放射自顯影。
3.細胞因子mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用特異性細胞因子引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增細胞因子cDNA,Southern blot后用標記探針檢測特異細胞因子DNA水平。
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