氧核糖核酸(英語:Deoxyribonucleic acid,縮寫為DNA)又稱去氧核糖核酸,是一種分子,可組成遺傳指令,以引導(dǎo)生物發(fā)育與生命機能運作。主要功能是長期性的資訊儲存,可比喻為“藍(lán)圖”或“食譜”[1]。其中包含的指令,是建構(gòu)細(xì)胞內(nèi)其他的化合物,如蛋白質(zhì)與RNA所需。帶有遺傳訊息的DNA片段稱為基因,其他的DNA序列,有些直接以自身構(gòu)造發(fā)揮作用,有些則參與調(diào)控遺傳訊息的表現(xiàn)。
DNA是一種長鏈聚合物,組成單位稱為核苷酸,而糖類與磷酸分子借由酯鍵相連,組成其長鏈骨架。每個糖分子都與四種堿基里的其中一種相接,這些堿基沿著DNA長鏈所排列而成的序列,可組成遺傳密碼,是蛋白質(zhì)氨基酸序列合成的依據(jù)。讀取密碼的過程稱為轉(zhuǎn)錄,是根據(jù)DNA序列復(fù)制出一段稱為RNA的核酸分子。多數(shù)RNA帶有合成蛋白質(zhì)的訊息,另有一些本身就擁有特殊功能,例如rRNA、snRNA與siRNA。
在細(xì)胞內(nèi),DNA能組織成染色體結(jié)構(gòu),整組染色體則統(tǒng)稱為基因組。染色體在細(xì)胞分裂之前會先行復(fù)制,此過程稱為DNA復(fù)制。對真核生物,如動物、植物及真菌而言,染色體是存放于細(xì)胞核內(nèi);對于原核生物而言,如細(xì)菌,則是存放在細(xì)胞質(zhì)中的類核里。染色體上的染色質(zhì)蛋白,如組織蛋白,能夠?qū)NA組織并壓縮,以幫助DNA與其他蛋白質(zhì)進行交互作用,進而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。
DNA有多種不同的構(gòu)象,其中有些構(gòu)象之間在構(gòu)造上的差異并不大。目前已辨識出來的構(gòu)象包括:A-DNA、B-DNA、C-DNA、D-DNA[47]、E-DNA[48]、H-DNA[49]、L-DNA[47]、P-DNA[50]與Z-DNA[26][51]。不過以現(xiàn)有的生物系統(tǒng)來說,自然界中可見的只有A-DNA、B-DNA與Z-DNA。DNA所具有的構(gòu)象可根據(jù)DNA序列、超螺旋的程度與方向、堿基上的化學(xué)修飾,以及溶液狀態(tài),如金屬離子與多胺濃度來分類[52]。三種主要構(gòu)象中以B型為細(xì)胞中最常見的類型[53],與另兩種DNA雙螺旋的差異,在于其幾何形態(tài)與尺寸。
A-DNA又稱A型DNA,為DNA雙螺旋的一種形式,擁有與較普遍的B-DNA相似的右旋結(jié)構(gòu),但其螺旋較短較緊密。A-DNA是三種具有生物活性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),另兩種則為B-DNA及Z-DNA。一般只有脫水的DNA樣本中才會出現(xiàn),可用來作晶體學(xué)實驗。此外當(dāng)DNA與RNA混合配對時,也可能出現(xiàn)A-DNA形式的螺旋。
是這些內(nèi)容吧——
1.DNA的結(jié)構(gòu)
(1)DNA的化學(xué)組成
(元素組成:C、H、O、N、P。)
①組成DNA的基本單位是脫氧核苷酸,它由一個脫氧苷糖、一個磷酸和一個含氮堿基組成。
②組成DNA的堿基有四種:腺嘌呤(A),鳥嘌呤(G),胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T);有四種脫氧核苷酸:腺嘌呤脫氧核苷酸,鳥嘌呤脫氧核苷酸,胞嘧啶脫氧核苷酸,胸腺嘧啶脫氧核苷酸。DNA的每一條鏈由四種不同的脫氧核苷酸聚合而成多脫氧核苷酸鏈。
(2)DNA分子的立體結(jié)構(gòu)
結(jié)構(gòu)的主要特點是:
①兩條長鏈按反向平行方式盤旋成雙螺旋結(jié)構(gòu)。
②脫氧核糖和磷酸交替連接,排列在DNA分子的外側(cè),構(gòu)成基本骨架,堿基排列在內(nèi)側(cè)。
③堿基互補配對原則:
兩條鏈上的堿基通過氫鍵連接成堿基對,且堿基配對有一定的規(guī)律:A—T、G—C(A一定與T配對,G一定與C配對)。
(3)DNA的特性
①穩(wěn)定性:DNA分子兩條長鏈上的脫氧核糖與Pi交替排列的順序和兩條鏈之間堿基互補配對的方式是穩(wěn)定不變的,從而導(dǎo)致DAN分子的穩(wěn)定性。
②多樣性:DNA分子中堿基相互配對的方式雖然不變,而長鏈中的堿基對的排列順序是千變?nèi)f化的。如一個最短的DNA分子大約有4000個堿基對,這些堿基對可能的排列方式就有2的4000次方種。實際上構(gòu)成DNA分子的脫氧核苷酸數(shù)目是成千上萬的,其排列種類幾乎是無限的,這就構(gòu)成DNA分子的多樣性。
③特異性:每個特定的DNA分子都具有特定的堿基排列順序,這種特定的堿基排列順序就構(gòu)成了DNA分子自身嚴(yán)格的特異性。
2.DNA的復(fù)制
(1)復(fù)制的概念
在細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)第一次分裂的間期,以母細(xì)胞DNA分子為模板,合成子代DNA的過程。DNA的復(fù)制實質(zhì)上是遺傳信息的復(fù)制。
(2)“準(zhǔn)確”復(fù)制的原理
①DNA具有獨特的雙螺旋結(jié)構(gòu),能為復(fù)制提供模板;
②堿基具有互補配對的能力,能夠使復(fù)制準(zhǔn)確無誤。
(3)DNA復(fù)制的過程
復(fù)制的過程大致可歸納為如下三點:
①解旋提供準(zhǔn)確模板:在ATP供能、解旋酶的作用下,DNA分子兩條多脫氧核苷酸鏈配對的堿基從氫鍵處斷裂,兩條螺旋的雙鏈解開,這個過程叫做解旋。解開的兩條單鏈叫母鏈(模板鏈)。
②合成互補子鏈:以上述解開的每一段母鏈為模板,以周圍環(huán)境中游離的4種脫氧核苷酸為原料,按照堿基互補配對原則,在有關(guān)酶的作用下,各自合成與母鏈互補的一段子鏈。
③子、母鏈結(jié)合盤繞形成新DNA分子:在DNA聚合酶的作用下,隨著解旋過程的進行,新合成的子鏈不斷地延伸,同時每條子鏈與其對應(yīng)的母鏈盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu),從而各自形成一個新的DNA分子,這樣,1DNA分子→2個完全相同的DNA分子。
(4)DNA復(fù)制的特點
①DNA分子是邊解旋邊復(fù)制的,是一種半保留式復(fù)制,即在子代雙鏈中,有一條是親代原有的鏈,另一條(子鏈)則是新合成的。
②DNA復(fù)制嚴(yán)格遵守堿基互補配對原則準(zhǔn)確復(fù)制。從而保證了子代和親代具有相同的遺傳性狀。
(5)DNA復(fù)制的必需條件
DNA復(fù)制時必需條件是親代DNA的兩條母鏈提供準(zhǔn)確模板、四種脫氧核苷酸為原料、能量(ATP)和一系列的酶,缺少其中任何一種,DNA復(fù)制都無法進行。
(6)DNA復(fù)制的生物學(xué)意義
DNA通過復(fù)制,使遺傳信息從親代傳給了子代,從而保證了物種的相對穩(wěn)定性,保持了遺傳信息的連續(xù)性,使種族得以延續(xù)。
是這些內(nèi)容吧—— 1.DNA的結(jié)構(gòu) (1)DNA的化學(xué)組成 (元素組成:C、H、O、N、P。)
①組成DNA的基本單位是脫氧核苷酸,它由一個脫氧苷糖、一個磷酸和一個含氮堿基組成。 ②組成DNA的堿基有四種:腺嘌呤(A),鳥嘌呤(G),胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T);有四種脫氧核苷酸:腺嘌呤脫氧核苷酸,鳥嘌呤脫氧核苷酸,胞嘧啶脫氧核苷酸,胸腺嘧啶脫氧核苷酸。
DNA的每一條鏈由四種不同的脫氧核苷酸聚合而成多脫氧核苷酸鏈。 (2)DNA分子的立體結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)的主要特點是: ①兩條長鏈按反向平行方式盤旋成雙螺旋結(jié)構(gòu)。
②脫氧核糖和磷酸交替連接,排列在DNA分子的外側(cè),構(gòu)成基本骨架,堿基排列在內(nèi)側(cè)。 ③堿基互補配對原則: 兩條鏈上的堿基通過氫鍵連接成堿基對,且堿基配對有一定的規(guī)律:A—T、G—C(A一定與T配對,G一定與C配對)。
(3)DNA的特性 ①穩(wěn)定性:DNA分子兩條長鏈上的脫氧核糖與Pi交替排列的順序和兩條鏈之間堿基互補配對的方式是穩(wěn)定不變的,從而導(dǎo)致DAN分子的穩(wěn)定性。 ②多樣性:DNA分子中堿基相互配對的方式雖然不變,而長鏈中的堿基對的排列順序是千變?nèi)f化的。
如一個最短的DNA分子大約有4000個堿基對,這些堿基對可能的排列方式就有2的4000次方種。實際上構(gòu)成DNA分子的脫氧核苷酸數(shù)目是成千上萬的,其排列種類幾乎是無限的,這就構(gòu)成DNA分子的多樣性。
③特異性:每個特定的DNA分子都具有特定的堿基排列順序,這種特定的堿基排列順序就構(gòu)成了DNA分子自身嚴(yán)格的特異性。 2.DNA的復(fù)制 (1)復(fù)制的概念 在細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)第一次分裂的間期,以母細(xì)胞DNA分子為模板,合成子代DNA的過程。
DNA的復(fù)制實質(zhì)上是遺傳信息的復(fù)制。 (2)“準(zhǔn)確”復(fù)制的原理 ①DNA具有獨特的雙螺旋結(jié)構(gòu),能為復(fù)制提供模板; ②堿基具有互補配對的能力,能夠使復(fù)制準(zhǔn)確無誤。
(3)DNA復(fù)制的過程 復(fù)制的過程大致可歸納為如下三點: ①解旋提供準(zhǔn)確模板:在ATP供能、解旋酶的作用下,DNA分子兩條多脫氧核苷酸鏈配對的堿基從氫鍵處斷裂,兩條螺旋的雙鏈解開,這個過程叫做解旋。解開的兩條單鏈叫母鏈(模板鏈)。
②合成互補子鏈:以上述解開的每一段母鏈為模板,以周圍環(huán)境中游離的4種脫氧核苷酸為原料,按照堿基互補配對原則,在有關(guān)酶的作用下,各自合成與母鏈互補的一段子鏈。 ③子、母鏈結(jié)合盤繞形成新DNA分子:在DNA聚合酶的作用下,隨著解旋過程的進行,新合成的子鏈不斷地延伸,同時每條子鏈與其對應(yīng)的母鏈盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu),從而各自形成一個新的DNA分子,這樣,1DNA分子→2個完全相同的DNA分子。
(4)DNA復(fù)制的特點 ①DNA分子是邊解旋邊復(fù)制的,是一種半保留式復(fù)制,即在子代雙鏈中,有一條是親代原有的鏈,另一條(子鏈)則是新合成的。 ②DNA復(fù)制嚴(yán)格遵守堿基互補配對原則準(zhǔn)確復(fù)制。
從而保證了子代和親代具有相同的遺傳性狀。 (5)DNA復(fù)制的必需條件 DNA復(fù)制時必需條件是親代DNA的兩條母鏈提供準(zhǔn)確模板、四種脫氧核苷酸為原料、能量(ATP)和一系列的酶,缺少其中任何一種,DNA復(fù)制都無法進行。
(6)DNA復(fù)制的生物學(xué)意義 DNA通過復(fù)制,使遺傳信息從親代傳給了子代,從而保證了物種的相對穩(wěn)定性,保持了遺傳信息的連續(xù)性,使種族得以延續(xù)。
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提取DNA主要有SDS和CTAB法,其實提取效果的好壞主要看提取的對象是什么樣的材料,在提取之前一定要好好分析材料的特性,然后在設(shè)計實驗步驟。
一)CTAB法
CTAB是一種去污劑,可溶解細(xì)胞膜,它能與核酸形成復(fù)合物,在高鹽溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的,當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)時,從溶液中沉淀,通過離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開,然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇。
(二)SDS法
利用高濃度的SDS,在較高溫度(55—65℃)條件下裂解細(xì)胞,使染色體離析,蛋白質(zhì)變性,釋放出核酸,然后采用提高鹽濃度及降低溫度的做法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀(最常用的是加入5M的KAc于冰上保溫,在低溫條件下KAc與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不溶物),離心除去沉淀后,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
以下是在提取熱帶水果DNA時設(shè)計的兩種不同方法步驟,對比起來CTAB法好,在禾本科植物效果差不多!
1、CTAB法
1) 在所需量的CTAB抽提液中加入2-巰基乙醇,使終濃度達(dá)2%(v/v)。將此溶液預(yù)熱至65℃。
對于每克新鮮的葉組織大約需要4ml的2-ME/CTAB抽提液。
2) 用液氮(-196℃)或干冰(-78℃)冷卻粉碎器/勻漿器,將0.5 g植物組織粉碎成細(xì)粉,然后將組織轉(zhuǎn)移到2.0 ml離心管。
3) 加入800 μl預(yù)熱的2-Me/CTAB,混合使之充分濕潤,于65℃溫育20 min,不時顛倒混勻。
4) 待冷至室溫后,加入800 μl氯仿/異戊醇(24:1),顛倒混勻至溶液呈乳濁狀----但不要振蕩。25℃,10000 rpm離心10 min。
5) 上清(~700 μl)轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中,加入5 μl RNaseA貯液,37℃溫育30 min。
6) 加入700 μl氯仿/異戊醇,顛倒混勻,25℃,10000 rpm離心10 min。
7) 上清(~600 μl)轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5 ml離心管中,加入600 μl異丙醇,顛倒混勻,室溫或-20℃放置20 min。
8) 25℃,12000 rpm,離心10 min,收集沉淀。
9) 去上清,加1 ml70%乙醇洗滌沉淀兩次。(25℃,12000 rpm,離心10 min)
10)涼干DNA,溶于50 μl ddH2O,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2、SDS法
① 將0.3 g植物材料于液氮速凍,然后在研缽中將其磨碎,將粉末轉(zhuǎn)至2 ml離心管中。
② 加入1.2 ml預(yù)熱至65℃的提取緩沖液(其中加入3 μl β—巰基乙醇,增加DNA的穩(wěn)定性),置65℃水浴中放置30分鐘,不時顛倒混勻。
③ 加入0.45 ml 5M的醋酸鉀,混勻,冰浴20分鐘,在10000 rpm離心20 min。需要的話,Miracloth紗布過濾除去沉淀,上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。
④ 加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),輕輕顛倒混勻,12000 rpm離心15 min。
⑤ 轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中,加5 μl RNaseA貯液,37℃溫育30 min。
⑥ 加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),輕輕顛倒混勻,12000 rpm離心15 min。
⑦ 轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中,加入0.7V異丙醇,輕輕顛倒混勻,-20℃放置30分鐘沉淀核酸。
⑧ 25℃,12000 rpm,離心10 min,收集沉淀。
⑨ 棄上清,70%乙醇洗兩次。
⑩ 涼干DNA,溶于50 μl ddH2O,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1、DNA提取把樣本細(xì)胞核中所含有DNA提取出來,然后進行一定的純化,化除樣本中的雜質(zhì)。
2、PCR擴增PCR的中文名為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),簡單的說,PCR擴增這一步就是把我們所需要的片段通過酶促反應(yīng),在PCR儀上進行大量復(fù)制,放大到通過某些專用儀器可以看到的程度。 3、后PCR反應(yīng)這一步主要是上ABI測序儀檢測的準(zhǔn)備階段,將雙鏈的DNA打開,加一些檢測用的的內(nèi)標(biāo),主要是用來標(biāo)記檢測的片段長度。
4、毛細(xì)管測序儀檢測由于DNA帶有電荷,通過毛細(xì)管電泳的方法,不同片段DNA長度的電泳速度不同,在同樣的電壓,同樣的電泳時間下,泳動的距離不同,這些長短不同距離可以通過前期加入的內(nèi)標(biāo)測量分辨出來,同時可通過一定的軟件顯示在電腦上,方便檢測人員處理和分析數(shù)據(jù)。 5、分析數(shù)據(jù),出具報告主要是檢測人員將所得結(jié)果進行分析匯總、計算,然后出鑒定結(jié)論和報告。
根據(jù)人和凈化多年的凈化工程經(jīng)驗,DNA實驗室裝修主要要注意以下幾個問題:
一、水路問題:上水的施工要考慮的是安全和科學(xué)還有適用。走上水時,要根據(jù)具體實驗來選擇材料也就是上水管和接頭。還要考慮水電的分離、水管周圍的環(huán)境、水路的走向等等。實驗室的下水一般比較麻煩,因為實驗室的下水規(guī)范要求和實際國情,還有具體的實驗室或?qū)嶒灅黔h(huán)境有很大的出入。
二、電路問題:實驗室的用電是一項很重要的問題,弱電、照明電、安全電和實驗設(shè)備用電。其中實驗室儀器設(shè)備用電為主要重點,因為實驗室的儀器設(shè)備特別是一些精密儀器,這些儀器設(shè)備的原理大都是洛倫茲力原理的作用和反作用,也就是通過電流的微變化,來控制數(shù)據(jù)的變化。實驗室儀器設(shè)備用電,我們所要解決的問題就是,控制和降低電流的變化浮動、減少或穩(wěn)定諧波的變化數(shù)值、減少或降低磁場的干擾等等。
三、排風(fēng)系統(tǒng)問題:實驗室的排風(fēng)主要是解決實驗人員的安全和實驗室環(huán)境的需要。實驗室的排送風(fēng)主要是考慮什么環(huán)境需要正壓和負(fù)壓還有恒壓。具體的配置要看,實驗室的具體性質(zhì),來安排正負(fù)壓的大小。實驗室的排送風(fēng),不像普通的辦公換風(fēng)。它的風(fēng)路和引導(dǎo)氣體走向有很嚴(yán)格的要求,解決不好就會產(chǎn)生氣體回流及氣體排不出去,或排風(fēng)量很大實驗室內(nèi)氣味仍然存在,達(dá)不到換風(fēng)的效果。實驗室的具體性質(zhì)不同,所要求的正負(fù)壓不同,風(fēng)量和換風(fēng)次數(shù)也不同。實驗室的具體性質(zhì)不同,所要達(dá)到的相對換風(fēng)和絕對換風(fēng)也是有著很大的差異。
四、最后實驗室的材料選擇也很重要,要根據(jù)不同的實驗性質(zhì),來選擇不同的材料去適應(yīng)實驗室特殊的環(huán)境。如腐蝕也要看是酸性的,還是堿性,還是有機物的。當(dāng)然還要考慮到實驗室的高溫和低溫環(huán)境。有些實驗區(qū)域可能還會考慮到材料的變形、老化、阻燃、輻射等情況。
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