注意事項:
1.底物濃度 除選擇適合的底物外,在實際應(yīng)用中更多考慮的是底物濃度。由于[S]與反應(yīng)速度V成雙曲線關(guān)系,在酶活性測定時,要求[S]達(dá)到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。[S]范圍一般選擇在10~20Km為宜,此時反應(yīng)速度基本達(dá)到最大反應(yīng)速度,測定的誤差在可接受范圍。
2.酶濃度 在反應(yīng)條件一定時,酶濃度與反應(yīng)速度成正比。按照中間產(chǎn)物學(xué)說,只有[S]>>[E]時,酶才能被底物分子飽和,反應(yīng)速度才能達(dá)到最大值。因此當(dāng)標(biāo)本酶活力過高時,應(yīng)將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后再加以測定。
3.溫度 不同的酶最適溫度可以不同,多數(shù)酶的最適溫度在37~40℃,高于或低于最適溫度,酶活性都降低。目前,酶活性的測定溫度尚未統(tǒng)一,但常規(guī)實驗室多使用37℃。溫度對酶促反應(yīng)的影響程度通常用溫度系數(shù)(Q10)表示。溫度系數(shù)指溫度每升高10℃,化學(xué)反應(yīng)速度增加的倍數(shù)。Q10通常為l~2。由溫度系數(shù)得知,溫度的變化對酶活性有著重要影響,因此要求酶活性測定要在恒溫條件下進(jìn)行,溫度波動要控制在±1℃。
4.離子強度和pH值 在最適pH時,酶的活性最強,高于或低于最適pH,酶的活性都降低,多數(shù)酶的最適pH在5~8之間。在測定酶活性時,要求緩沖液具有足夠的緩沖容量,以便使pH值保持穩(wěn)定。血漿或血清標(biāo)本含有多種緩沖溶質(zhì),具有較強的緩沖能力。為了防止血漿或血清標(biāo)本緩沖溶質(zhì)對反應(yīng)液酸堿度的影響,使pH不致偏離設(shè)定值,標(biāo)本用量不宜過大,血漿或血清標(biāo)本體積/反應(yīng)液體積≤1/10為宜。
5 輔助因子 某些金屬離子和維生素類輔酶是結(jié)合酶的輔助因子,例如Zn2+是羧基肽酶的輔基,Mo6+是黃嘌呤氧化酶的輔基,NADH是不需氧脫氫酶的輔酶。這些酶離開它們的輔基或輔酶就不能表現(xiàn)活性,因此在酶活性測定時,就要保證輔基或輔酶的供給。
6.激活劑 有些酶在有激活劑存在時才有活性或活性較高,例如Mg2+是肌酸激酶的激活劑,Cl-是淀粉酶的激活劑。因此在酶活性測定時,也要滿足酶對激活劑的需要。
7.抑制劑 酶的抑制可分為不可逆抑制和可逆抑制,后者又可分為競爭性抑制和非競爭性抑制。重金屬離子和砷化物對巰基酶的抑制、有機磷對羥基酶的抑制屬于不可逆抑制;丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制、磺胺類藥物對二氫葉酸合成酶的抑制屬于競爭性抑制;哇巴因?qū)a+,K+-ATP酶的抑制屬于非競爭性抑制。抑制劑使酶活性降低,在測定酶活性時,應(yīng)避免抑制劑的影響。
綜上所述,測定酶活性時,最適條件的選擇應(yīng)該遵循最適底物濃度、最適溫度、最適pH值、滿足輔助因子和激活劑、避免抑制劑的原則。
酶的活性測定要求有適宜的特定反應(yīng)條件,應(yīng)注意影響酶促反應(yīng)速度的各種因素應(yīng)該相對恒定。
1.酶的樣品應(yīng)做適當(dāng)?shù)奶幚怼?.反應(yīng)體系中,底物的量足夠使酶被底物飽和,以充分反映待測酶的活力。
但過高的底物濃度可能抑制酶的活性,一般底物濃度在10km以上。3.測定代謝物時應(yīng)保持酶的足夠濃度。
4.應(yīng)根據(jù)反應(yīng)時間選擇反應(yīng)的最適溫度。5.根據(jù)不同的底物和緩沖液選擇反應(yīng)的最適pH。
6.為獲取最高反應(yīng)速度,在反應(yīng)體系中應(yīng)含有適宜的輔助因子,激活劑等。7.測定酶活性時應(yīng)測定酶促反應(yīng)的初速度。
需要,舉例說明:正交實驗法舉例: 用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影響 目的要求 1.初步掌握正交實驗設(shè)計方法的使用 2.求出蔗糖酶的最適溫度和最適pH值 實驗原理 酶的催化作用是在一定條件下進(jìn)行的,它受多種因素的影響,如:底物濃度、酶濃度、溶液的pH值和離子濃度、溫度、抑制劑和激活劑等都能影響催化反應(yīng)的速度。
通常是在其他因素恒定的條件下,通過對某因素在一系列變化條件下的酶活性測定,求得該因素對酶活力的影響,這是單因素的簡單比較法。 本實驗用正交法測定溫度、pH值、底物濃度和酶濃度四種因素對蔗糖酶活性的影響,這是多因素(≥3)的實驗方法。
正交法是通過正交表安排多因素實驗,利用統(tǒng)計數(shù)學(xué)原理進(jìn)行數(shù)據(jù) 分析的一種科學(xué)方法,它符合“以盡量少的試驗,獲得足夠的、有效的信 息”的實驗設(shè)計原則。正交試驗法的程序為下列八個步驟: (1)確定試驗?zāi)康摹?/p>
實驗?zāi)康氖嵌喾N多樣的,如找出產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)的最佳組合、確定最佳工藝條件等。本實驗的目的是為了提高酶的反應(yīng)速度,提高酶的活力。
(2)選擇質(zhì)量特性指標(biāo)。應(yīng)選擇能提高或改進(jìn)的質(zhì)量特性及因素效應(yīng)。
對于本實驗來說就是產(chǎn)物(葡萄糖)生成量的多少。 (3)選定相關(guān)因素。
即選擇和確定可能對實驗結(jié)果或質(zhì)量特性值有影響的那些因素,可人為控制與調(diào)節(jié)的因素,如溫度、pH等。這些因素之間有相互獨立性。
(4)確定水平。水平,又稱位級,是因素的一個給定值或一種特定的措施,或一種特定的狀態(tài)。
水平也就是因素變化的各種狀態(tài)。在確定水平時,應(yīng)考慮選擇范圍、水平數(shù)和水平位置。
如本實驗的溫度水平可以選擇20℃、30 ℃、50 ℃三個水平。 (5)選用正交表。
應(yīng)從因素數(shù)、水平數(shù)以及有無重點因素需要強化考察等各方面綜合考慮選用正交表。一般情況下,首先根據(jù)水平數(shù)選用2或3系列表,然后,以容納試驗因素數(shù),選用實驗次數(shù)最少的正交表。
如有重點考察的因素,則根據(jù)其多考察的水平數(shù),選混合型正交表。 (6)配列因素水平,制定實驗方案。
按隨機原則,把因素配列于選用的正交表中,制定實驗的順序、時間等,即制定實驗具體方案。 (7)實施實驗方案。
按實驗方案,認(rèn)真、正確地試驗,如實記錄各種實驗數(shù)據(jù)。 (8)實驗結(jié)果分析。
對實驗中取得的各種數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如從數(shù)據(jù)中直接選出符合或接近質(zhì)量特性期望值的實驗條件組。
如不能采用直觀分析方法,則應(yīng)采用其他分析方法,確定各因素主次地位可用極差分析方法,定量分析各個因素對實驗結(jié)果的影響程度,則用方差分析方法。 操作方法 1.實驗設(shè)計: 1)確定指標(biāo):即實驗的結(jié)果。
本實驗的指標(biāo)是酶活力。這里,用A520值表示。
2)制定因素水平表:考察四個因素(溫度、pH值、底物濃度和酶濃度),每個因素取三個水平(如溫度選擇20℃、35 ℃ 和50 ℃ 三個水平)。水平是因素變化的范圍(通常是根據(jù)專業(yè)知識確定。
如無資料可借鑒,應(yīng)先加寬范圍再逐步縮小)內(nèi)要進(jìn)行實驗的具體條件,如表1。 表1 因素水平表 3)選擇正交表:可容納三因素三水平的正交表有L9(34)、L27(313)、L18(36*6)和L27(38*9)。
本實驗不考察各因素間的交互作用,也沒設(shè)計混合水平,只有水平數(shù)均為3的的四個因素,故選用L9(34)表,見表2。 分析: A. 判斷各因素的水平范圍是否選偏; B. 判斷各因素顯著性大小的順序; C. 判斷實驗結(jié)果的置信度。
實驗安排 具體操作步驟: 1、將已配制好的三種不同pH的0.2mol/L的緩沖液于試管中。 2、將酶粉用蒸餾水溶解(適當(dāng)體積10-30ml不等),離心去 除不溶物,10,000rpm/min,10min,4℃。
3、酶活預(yù)示實驗,確定酶的稀釋倍數(shù)。(可根據(jù)產(chǎn)物稀釋的 倍數(shù)來確定酶的稀釋倍數(shù))A520在0.4-2.0之間即可。
4、準(zhǔn)備10支試管。其中一支為“0”號管,作為測量時的參 比溶液。
其他九支試管根據(jù)前面的圖表3加入相關(guān)的溶 液,分別在不同的條件下進(jìn)行酶反應(yīng)。利用二硝基水楊酸 的方法測定不同管在A520下的光密度值。
5、計算同一因素不同水平的級差,級差小代表離散度小, 表示該水平為酶反應(yīng)的最適條件。 1)數(shù)據(jù)記錄:將上述兩組平行實驗的結(jié)果取平均值后的9個數(shù)據(jù),填入表4中的Yi項內(nèi)。
2)數(shù)據(jù)整理及分析:對于一般的實驗,可用極差分析,該分析方法簡單、直觀。對要求精細(xì)的實驗,則要用方差分析,該方法可給出誤差的大小估計,但有一定的計算量。
對于有混合水平的正交實驗,只能用方差分析。
(1)酶促反應(yīng)過程中,只有最初一段時間內(nèi)反應(yīng)速度與酶濃度成正比,隨著反應(yīng)時間的延長,反應(yīng)速度即逐漸降低。
(2)要規(guī)定一定的反應(yīng)條件,如時間、溫度、pH等,并在酶測定過程中保持這些反應(yīng)條件的恒定,如溫度不得超過規(guī)定溫度的士1℃,pH應(yīng)恒定。
(3)配制的底物濃度應(yīng)準(zhǔn)確且足夠大,底物液中應(yīng)加入不抑制該酶活力的防腐劑并保存于冰箱中,以防止底物被分解。
(4)標(biāo)本要新鮮,由于絕大多數(shù)酶可因久置而活力降低,標(biāo)本如無法及時測定,應(yīng)保存于冰箱中。用血漿時,應(yīng)考慮到抗凝劑對酶反應(yīng)的影響。有些酶在血細(xì)胞、血小板中的濃度比血清高,為此在采血、分離血清時,應(yīng)注意防止溶血和白細(xì)胞的破裂。
(5)在測定過程中,所用儀器應(yīng)絕對清潔,不應(yīng)含有酶的抑制物,如酸、堿、蛋白沉淀劑等。
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