馬卡斯亮藍溶液使用(考馬斯亮藍G)
1.考馬斯亮藍G
考馬斯亮藍與蛋白質(zhì)結(jié)合是一個很快的過程，約2 min即可反應完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1 h。之后，蛋白質(zhì)-染料復合物發(fā)生聚合并沉淀出來。一般在反應5min后開始測定。
選用的標準品預先用凱氏定氮法準確測得蛋白純度，然后根據(jù)需要，用NaCl溶液或蒸餾水配制成標準溶液（含標準蛋白100μg/mL）。
最好用去離子水配制試劑。
先將考馬斯亮藍配制成母液（低溫下可長期放置），工作液要現(xiàn)用現(xiàn)配。都避光、低溫保存。
做標準曲線時，其回歸方程的相關(guān)系數(shù)應達到3個9（即r值至少為0.999），標準曲線方可用。試劑或儀器更換，一定重新做標準曲線。
測定樣品的條件一定要與做標準曲線的條件相一致。
蛋白糖化物對考馬斯亮藍法存在干擾，因此，應用考馬斯亮藍法測定含糖基蛋白的制品時需進一步改進。
去污劑（如 Triton X-100、SDS）,Tris,NaOH，植物樣品中的酚類、有機酸等，是常見的干擾物。
試驗中所需器皿一定要干凈、干燥，各試液取量一定要準確。
2.考馬斯亮藍法測蛋白濃度,具體步驟有哪些,需要什么試劑
該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0.2%影響測定結(jié)果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1.Bradford濃染液的配制：將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50m1 95%乙醇，加入100ml濃磷酸，然后，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩(wěn)定。
2.標準曲線蛋白質(zhì)樣本的準備：盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標準品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標準蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標準曲線。
3.將待測樣本溶于100~1緩沖溶液中，該緩沖溶液應與制作標準曲線的緩沖溶液相同（最好用PBS）。
4.按1:5用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過濾除去。
5.每個樣本加5ml稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5~30rain。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min.
6.根據(jù)標準曲線計算待測樣本的濃度。
注意：
考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，反應快速，并且穩(wěn)定，無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙
三、考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量—標準曲線制作
（一）、試劑：
1、考馬斯亮藍試劑：
考馬斯亮藍G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過濾。最終試劑中含0.01%(W/V)考馬斯亮藍G—250,4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)H3PO4。
2、標準蛋白質(zhì)溶液：
純的牛血清血蛋白，預先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：
1、722S型分光光度計使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、標準曲線制作：
試管編號 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml標準蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考馬斯亮藍試劑 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
搖勻，1h內(nèi)以1號管為空白對照，在595nm處比色
A595nm
1、
2、以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標（六個點為10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐標軸上繪制標準曲線。
1）、利用標準曲線查出回歸方程。
2）、用公式計算回歸方程。
3）、或用origin作圖 ，測出回歸線性方程。即A595nm=a*X( )+6
一般相關(guān)系數(shù)應過0.999以上，至少2個9以上。
4）、繪圖時近兩使點在一條直線上，在直線上的點應該在直線兩側(cè)。
（四）、蛋白質(zhì)含量的測定：
樣品即所測蛋白質(zhì)含量樣品（含量應處理在所測范圍內(nèi)），依照操作步驟1操作，測出樣品的A595nm，然后利用標準曲線或回歸方程求出樣品蛋白質(zhì)含量。
一般被測樣品的A595nm值在0.1—0.05之間，所以上述樣品如果A595nm值太大，可以稀釋后再測A595nm值，然后再計算。
（五）、注意事項：
1、玻璃儀器要洗滌干凈。
2、取量要準確。
3、玻璃儀器要干燥，避免溫度變化。
4、對照：用被測物質(zhì)以外的物質(zhì)作空白對照。
