測定微生物計數(shù)的方法有很多,主要有以下幾種:
1.血細胞計數(shù)法
將稀釋的菌液樣品滴在血細胞計數(shù)板上,在顯微鏡下計算4~5個中格的細菌數(shù),并求出每個小格所含細菌的平均數(shù),再以此為依據(jù),估算總菌數(shù).
①此法的缺點是不能區(qū)分死菌和活菌.
②對壓在小方格界線上的細菌,應(yīng)當取平均值計數(shù).
③此法可用于測定培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化
2.稀釋涂布平板法
原理:每個活細菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落.培養(yǎng)基表面生長的一個菌落,來源于樣品稀釋液中的一個活菌.
①這一方法常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目
②統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低,原因是當兩個活多個細胞連在一起時,平板上觀察到的只是一個菌落.因此統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示.
③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽孢與孢子等的數(shù)量均可用此法測定.但不適于測定樣品中絲狀體微生物,例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營養(yǎng)體等.
④此法若不培養(yǎng)成菌落,可通過將一定量的菌液均勻地涂布在玻片上的一定面積上,經(jīng)固定染色后在顯微鏡下計數(shù),這樣又稱涂片計數(shù)法.染色可用臺盼藍,臺盼藍能使死細胞染成藍色,可分別計數(shù)死細胞和活細胞.
3.濾膜法
濾膜法是當樣品中菌數(shù)很低時,可將一定體積的湖水、海水或飲用水燈樣品通過膜過濾器.然后將濾膜干燥、染色,并經(jīng)處理使膜透明,再在顯微鏡下計算膜上(或一定面積上)的細菌數(shù).
此法也可以通過培養(yǎng)觀察形成的菌落數(shù)來推算樣品中的菌數(shù).例如測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目:將已知體積的水過濾后,將濾膜放在伊紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng).在該培養(yǎng)基上大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色,可根據(jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目,計算出水樣中大腸桿菌的數(shù)目.
此法也是統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目.
4.比濁法
原理是在一定范圍內(nèi),菌是懸液中細胞濃度與混濁度成正比,即與光密度成正比,菌越多,光密度越大.因此可借助與分光光度計,在一定波長下,測定菌懸液的光密度,以光密度表示菌量.實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi),否則不準確.
5.顯微鏡直接計數(shù)法
在課本生物選修1生物技術(shù)實踐P22中“除了上述活菌計數(shù)法外,顯微鏡直接計數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法.”這里說的顯微鏡直接計數(shù),我認為應(yīng)該是在稀釋涂布的基礎(chǔ)上不培養(yǎng)成菌落而通過染色的方法在顯微鏡下直接計數(shù).再如濾膜法也一樣,可以有兩種情況.
另外,微生物計數(shù)法發(fā)展迅速,多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法可以用來統(tǒng)計微生物的數(shù)目.
微生物的顯微直接計數(shù)法
一、實驗?zāi)康?/p>
了解血球計數(shù)板的構(gòu)造、計數(shù)原理和計數(shù)方法,掌握顯微鏡下直接計數(shù)的技能。
二、實驗原理
測定微生物細胞數(shù)量的方法很多,通常采用的有顯微直接計數(shù)法和平板計數(shù)法。
顯微計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液,如有雜菌或雜質(zhì),常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板,一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤(Petrof Hausser)細菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同,只是細菌計數(shù)板較薄,可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚,不能使用油鏡,計數(shù)板下部的細菌不易看清。
血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片,載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬,其中間又被一短橫槽分隔成兩半,每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)(圖21-1),計數(shù)區(qū)的刻度有兩種:一種是計數(shù)區(qū)分為16個大方格(大方格用三線隔開),而每個大方格又分成25個小方格;另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個大方格(大方格之間用雙線分開),而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造,它們都有一個共同特點,即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。
計數(shù)區(qū)邊長為1mm,則計數(shù)區(qū)的面積為l mm2,每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后,計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm,所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3,每個小方格的體積為1/4000mm3。
使用血球計數(shù)板計數(shù)時,先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量,再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細胞的數(shù)量。
已知:1mm3體積=10 mm*10 mm*10 mm= 1000mm3
所以:1mm3體積應(yīng)含有小方格數(shù)為1000mm3/1/4000mm3=4*106個小方格,即系數(shù)K=4*106 。
因此:每ml菌懸液中含有細胞數(shù)= 每個小格中細胞平均數(shù)(N)*系數(shù)(K)*菌液稀釋倍數(shù)(d)
三、實驗器材
1.活材料:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面或培養(yǎng)液。
2.器材:顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片(22mm*22mm)、吸水紙、計數(shù)器、滴管、擦鏡紙。
四、實驗方法
1.視待測菌懸液濃度,加無菌水適當稀釋(斜面一般稀釋到10-2),以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。
2.取潔凈的血球計數(shù)板一塊,在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。
3.將酵母菌懸液搖勻,用滴管吸取少許,從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴(不宜過多),讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū),勿使氣泡產(chǎn)生,并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上,不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液,以免加蓋蓋玻片后,造成計數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡)。4.靜置片刻,將血球計數(shù)板置載物臺上夾穩(wěn),先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后,再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近,觀察時應(yīng)減弱光照的強度。
5.計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成,按對角線方位,數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格(即100小格)的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū),除數(shù)上述四個大方格外,還需數(shù)中央l個大方格的菌數(shù)(即80個小格)。如菌體位于大方格的雙線上,計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線,數(shù)左線不數(shù)右線,以減少誤差。
6.對于出芽的酵母菌,芽體達到母細胞大小一半時,即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復(fù)計數(shù)2—3次(每次數(shù)值不應(yīng)相差過大,否則應(yīng)重新操作),求出每一個小格中細胞平均數(shù)(N),按公式計算出每ml(g)菌懸液所含酵母菌細胞數(shù)量。
7.測數(shù)完畢,取下蓋玻片,用水將血球計數(shù)板沖洗干凈,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干,放入盒內(nèi)保存。
五、實驗作業(yè):
將實驗結(jié)果填入下表中:
計數(shù)次數(shù) 每個大方格菌數(shù) 稀 釋
倍 數(shù) 試管斜面中的總菌數(shù) 平均值
1 2 3 4 5
第一次
第二次
微生物檢驗方法標準 1 食品微生物學檢驗 總則 GB 4789.1-2010 2 菌落總數(shù)測定 GB 4789.2-2010 3 大腸菌群計數(shù) GB 4789.3-2010 4 沙門氏菌檢驗 GB 4789.4-2010 5 金黃色葡萄球菌檢驗 GB4789.10-2010 6 霉菌和酵母計數(shù) GB4789.15-2010 7 乳與乳制品檢驗 GB4789.18-2010 8 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗 GB4789.30-2010 9 乳酸菌檢驗 GB 4789.35-2010 10 阪崎腸桿菌檢驗 GB4789.40-2010 11 志賀氏菌檢驗 GB 4789.5-2012 12 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗 GB4789.13-2012 13 雙歧桿菌的鑒定 GB4789.34-2012 14 大腸埃希氏菌計數(shù) GB 4789.38-2012 15 副溶血性弧菌檢驗 GB4789.7-2013 16 商業(yè)無菌檢驗 GB4789.26-2013 17培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求 GB4789.28-2013 18沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗 GB 4789.31-2013 19 糞大腸菌群計數(shù) GB 4789.39-2013 20 空腸彎曲菌檢驗 GB4789.9-2014 21 β型溶血性鏈球菌檢驗 GB4789.11-2014 22 蠟樣芽孢桿菌檢驗 GB4789.14-2014 23小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗 GB4789.8-2016 24 腸桿菌科檢驗 GB4789.41-2016。
測定微生物細胞數(shù)目的方法有很多,介紹幾種1.血細胞計數(shù)法將稀釋的菌液樣品滴在血細胞計數(shù)板上,在顯微鏡下計算4~5個中格的細菌數(shù),并求出每個小格所含細菌的平均數(shù),再以此為依據(jù),估算總菌數(shù)。
①此法的缺點是不能區(qū)分死菌和活菌。②對壓在小方格界線上的細菌,應(yīng)當取平均值計數(shù)。
③此法可用于測定培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化2.稀釋涂布平板法原理:每個活細菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。培養(yǎng)基表面生長的一個菌落,來源于樣品稀釋液中的一個活菌。
①這一方法常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目②統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低,原因是當兩個活多個細胞連在一起時,平板上觀察到的只是一個菌落。因此統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。
③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽孢與孢子等的數(shù)量均可用此法測定。但不適于測定樣品中絲狀體微生物,例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營養(yǎng)體等。
④此法若不培養(yǎng)成菌落,可通過將一定量的菌液均勻地涂布在玻片上的一定面積上,經(jīng)固定染色后在顯微鏡下計數(shù),這樣又稱涂片計數(shù)法。染色可用臺盼藍,臺盼藍能使死細胞染成藍色,可分別計數(shù)死細胞和活細胞。
3.濾膜法 濾膜法是當樣品中菌數(shù)很低時,可將一定體積的湖水、海水或飲用水燈樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色,并經(jīng)處理使膜透明,再在顯微鏡下計算膜上(或一定面積上)的細菌數(shù)。
此法也可以通過培養(yǎng)觀察形成的菌落數(shù)來推算樣品中的菌數(shù)。例如測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目:將已知體積的水過濾后,將濾膜放在伊紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
在該培養(yǎng)基上大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色,可根據(jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目,計算出水樣中大腸桿菌的數(shù)目。此法也是統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目。
4.比濁法原理是在一定范圍內(nèi),菌是懸液中細胞濃度與混濁度成正比,即與光密度成正比,菌越多,光密度越大。因此可借助與分光光度計,在一定波長下,測定菌懸液的光密度,以光密度表示菌量。
實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi),否則不準確。 5.顯微鏡直接計數(shù)法在課本生物選修1生物技術(shù)實踐P22中“除了上述活菌計數(shù)法外,顯微鏡直接計數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法。”
這里說的顯微鏡直接計數(shù),我認為應(yīng)該是在稀釋涂布的基礎(chǔ)上不培養(yǎng)成菌落而通過染色的方法在顯微鏡下直接計數(shù)。再如濾膜法也一樣,可以有兩種情況。
另外,微生物計數(shù)法發(fā)展迅速,多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法可以用來統(tǒng)計微生物的數(shù)目。
原發(fā)布者:jxc2520
食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定一、培養(yǎng)基和試劑1、平板計數(shù)瓊脂(platecountagar,PCA)培養(yǎng)基成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mLpH7.0±0.2制法:將上述成分加于蒸餾水中,煮沸溶解,調(diào)節(jié)pH。分裝試管或錐形瓶,121℃高壓滅菌15min。2、磷酸鹽緩沖液成分磷酸二氫鉀(KH2PO4)34.0g蒸餾水500mLpH7.2制法:貯存液:稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中,用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH,用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液:取貯存液1.25mL,用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于適宜容器中,121℃高壓滅菌15min。3、無菌生理鹽水成分氯化鈉8.5g蒸餾水1000mL制法:稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中,121℃高壓滅菌15min。二、操作步驟樣品的稀釋1、固體和半固體樣品:稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min,或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1:10的樣品勻液。2、液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當數(shù)量
細菌計數(shù)1.計數(shù)器測定法:
即用血細胞計數(shù)器進行計數(shù)。取一定體積的樣品細胞懸液置于血細胞計數(shù)器的計數(shù)室內(nèi),用顯微鏡觀察計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的(O.1mm3),因而根據(jù)計數(shù)器刻度內(nèi)的細菌數(shù),可計算樣品中的含菌數(shù)。本法簡便易行,可立即得出結(jié)果。
本法不僅適于細菌計數(shù),也適用于酵母菌及霉菌孢子計數(shù)。
2、電子計數(shù)器計數(shù)法:
電子計數(shù)器的工作原理是測定小孔中液體的電阻變化,小孔僅能通過一個細胞,當一個細胞通過這個小孔時,電阻明顯增加,形成一個脈沖,自動記錄在電子記錄裝置上。
該法測定結(jié)果較準確,但它只識別顆粒大小,而不能區(qū)分是否為細菌。因此,要求菌懸液中不含任何碎片。
3、活細胞計數(shù)法
常用的有平板菌落計數(shù)法,是根據(jù)每個活的細菌能長出一個菌落的原理設(shè)計的。取一定容量的菌懸液,作一系列的倍比稀釋,然后將定量的稀釋液進行平板培養(yǎng),根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù),可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。此法靈敏度高,是一種檢測污染活菌數(shù)的方法,也是目前國際上許多國家所采用的方法。使用該法應(yīng)注意:①一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進行計數(shù),過多或過少均不準確;②為了防止菌落蔓延,影響計數(shù),可在培養(yǎng)基中加入O.001%2,3,5一氯化三苯基四氮唑(TTC);③本法限用于形成菌落的微生物。
廣泛應(yīng)用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細菌檢驗,是最常用的活菌計數(shù)法。
4、比濁法
比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測定細菌的數(shù)量。細菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比,與光密度成正比,所以,可用光電比色計測定菌液,用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。
此法簡便快捷,但只能檢測含有大量細菌的懸浮液,得出相對的細菌數(shù)目,對顏色太深的樣品,不能用此法測定。
5、測定細胞重量法
此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進行稱重;干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后,以清水洗凈放人干燥器加熱烘干,使之失去水分然后稱重。
此法適于菌體濃度較高的樣品,是測定絲狀真菌生長量的一種常用方法。
6、測定細胞總氮量或總碳量
氮、碳是細胞的主要成分,含量較穩(wěn)定,測定氮、碳的含量可以推知細胞的質(zhì)量。此法適于細胞濃度較高的樣品。
7、顏色改變單位法(colour change unit,簡稱CCU)
這種方法通常用于很小,用一般的比濁法無法計數(shù)的微生物,比如支原體等,因為支原體的液體培養(yǎng)物是完全透明的,呈現(xiàn)為清亮透明紅色,因此無法用比濁法來計數(shù),由于支原體固體培養(yǎng)很困難,用cfu法也不容易計數(shù),因此需要用特殊的計數(shù)方法,即CCU法。它是以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標,來計數(shù)微生物的相對含量的,下面以解脲脲原體為例單介紹其操作:,簡
(1)取12只無菌試管,每一管裝1.8ml解脲脲原體培養(yǎng)基。
(2)在第一管加入0.2ml待測解脲脲原體菌液,充分混勻,從中吸取0.2ml加入第二管,依次類推,10倍梯度稀釋,一直到最末一管
(3)于37度培養(yǎng),以培養(yǎng)基顏色改變的最末一管作為待測菌液的CCU,也就是支原體的最大代謝活力,比如第六管出現(xiàn)顏色改變,他的相對濃度就是10的6次方CCU/ml.
一般來說,比濁法和菌落計數(shù)法就可以滿足絕大多數(shù)細菌的計數(shù),但是對支原體這樣比較特殊的微生物,用CCU法比較合適。
微生物檢驗方法標準 1 食品微生物學檢驗 總則 GB 4789.1-2010 2 菌落總數(shù)測定 GB 4789.2-2010 3 大腸菌群計數(shù) GB 4789.3-2010 4 沙門氏菌檢驗 GB 4789.4-2010 5 金黃色葡萄球菌檢驗 GB4789.10-2010 6 霉菌和酵母計數(shù) GB4789.15-2010 7 乳與乳制品檢驗 GB4789.18-2010 8 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗 GB4789.30-2010 9 乳酸菌檢驗 GB 4789.35-2010 10 阪崎腸桿菌檢驗 GB4789.40-2010 11 志賀氏菌檢驗 GB 4789.5-2012 12 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗 GB4789.13-2012 13 雙歧桿菌的鑒定 GB4789.34-2012 14 大腸埃希氏菌計數(shù) GB 4789.38-2012 15 副溶血性弧菌檢驗 GB4789.7-2013 16 商業(yè)無菌檢驗 GB4789.26-2013 17培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求 GB4789.28-2013 18沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗 GB 4789.31-2013 19 糞大腸菌群計數(shù) GB 4789.39-2013 20 空腸彎曲菌檢驗 GB4789.9-2014 21 β型溶血性鏈球菌檢驗 GB4789.11-2014 22 蠟樣芽孢桿菌檢驗 GB4789.14-2014 23小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗 GB4789.8-2016 24 腸桿菌科檢驗 GB4789.41-2016。
v常用測定微生物生長的方法有:1)稱干重法。
可用離心法或過濾法測定。優(yōu)點:可適用于一切微生物,缺點:無法區(qū)別死菌和活菌。
2)比濁法。原理:由于微生物在液體培養(yǎng)時,原生質(zhì)的增加導(dǎo)致混濁度的增加,可用分光光度計測定。
優(yōu)點:比較準確。3)測含氮量,大多數(shù)微生物的含氮量占干重的比例較一致,根據(jù)含氮量再乘以6.25即可測得其粗蛋白的含量。
4)血球計數(shù)板法。優(yōu)點:簡便、快速、直觀。
缺點:結(jié)果包括死菌和活菌。5)液體稀釋法。
對未知菌樣作連續(xù)的10倍系列稀釋,經(jīng)培養(yǎng)后,記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù),然后查MPN表,再根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)就可計算其中的活菌含量。優(yōu)點:可計算活菌數(shù),較準確。
缺點:比較繁瑣。6)平板菌落計數(shù)法。
取一定體積的稀釋菌液涂布在合適的固體培養(yǎng)基,經(jīng)培養(yǎng)后計算原菌液的含菌數(shù)。優(yōu)點,可以獲得活菌的信息。
缺點:操作繁瑣,需要培養(yǎng)一定時間才能獲得,測定結(jié)果受多種因素的影響。
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