原位雜交(原位雜交的原位雜交試驗(yàn))
1.原位雜交的原位雜交試驗(yàn)
收集斑馬魚(yú)的胚胎，在Holfretor水中培養(yǎng)，到達(dá)所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí)，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時(shí)后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C 保存，待用（兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。
或者使用苯锍脲稀溶液培養(yǎng)，可阻斷色素的形成） 1. 重新水化和固定1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘。2） 置換成30%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復(fù)一次4） 置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定（本實(shí)驗(yàn)不做此步）1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理，5體節(jié)到24小時(shí)的胚胎處理3分鐘，24小時(shí)以上的胚胎處理5分鐘或者更長(zhǎng)。
發(fā)育時(shí)間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時(shí)間長(zhǎng)的胚胎就需要用蛋白酶來(lái)疏松組織，以便于雜交。2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
2. 預(yù)雜交1）每個(gè)管中置換成大約300ulHYB-溶液，60℃水浴5分鐘，避免振蕩。2）用等體積的HYB+取代HYB-。
3)60℃水浴，預(yù)雜交4小時(shí)以上。3. 雜交1）吸去預(yù)雜交的HYB+，加上100ul已加入探針的HYB+溶液（探針濃度約為1ng/ul）..2)60℃ 溫浴過(guò)夜。
注：雜交與預(yù)雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結(jié)合越好，溫度越高，背景越小。 1.1）將探針回收，放于-20C保存（通常探針可重復(fù)使用十次左右）。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。3）置換2XSSCT1ml,60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml,60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。2.1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dòng)。
2）室溫下加1ml 1:2:7溶液，時(shí)間為一小時(shí)。3）按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰箱過(guò)夜。
1） 用1ml含10%熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時(shí)以上，最后用1mlMABT溶液置換，25分鐘。2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘。
3）將胚胎轉(zhuǎn)入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動(dòng)，室溫下顯色。4）每隔一小時(shí)觀察胚胎是否開(kāi)始顯色5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。
6)4C冰箱保存。原位雜交中溶液的配制：PBS:NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24gDEPC H2O 1LHCl 調(diào)PH值至7.4抽濾，滅菌4% 多聚甲醛：多聚甲醛 40gPBS 1L加熱持續(xù)攪拌至溶液澄清。
-20℃保存PBST:PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0.1%。20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2gNaCl 175.5gDEPC H2O 至1L抽濾，滅菌SSCT:SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB-：甲酰胺：20XSSC儲(chǔ)液：DEPC水=2:1:1配制加入Tween-20使其終濃度為0.1%,-20c保存。HYB+:HYB- 20mlyeast RNA 10mgheparin 1mg。
-20℃保存。MAB:maleic acid 11.6gNaCl 8.8g用固體NaOH（約7g）調(diào)至Ph=7.54℃保存MABTMAB加上Tween-20使其終濃度為0.1%.10% blocking reagent:blocking reagent 8gMAB 72ml1:2:7溶液：滅活羊血清：10% BM blocking reagent:MABT=1:2:7用時(shí)現(xiàn)配Staining buffer:Tris 12.1gpH9.5Mgcl 6H2O 10.2g,Nacl 5.85gTween-20 1ml，用之前加1M的左旋咪唑儲(chǔ)液，使之終濃度為1mM。
2.原位雜交的主要程序
1、使用地高辛標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行石蠟切片的RNA原位雜交第一天
1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
2） 無(wú)水乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
3) 95%乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
4) PBS清洗3分鐘；
5) 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
6) PBS清洗10分鐘；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分鐘；
8) PBS清洗2次，每次3分鐘；
9) 0.2N的HCl孵育30分鐘；
10)PBS清洗2次，每次3分鐘；
11)0.25%無(wú)水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
12)PBS清洗2次，每次5分鐘；
13）預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘；
14）準(zhǔn)備核酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針，85℃加熱5分鐘，置于冰塊中10分鐘；
15）雜交；第二天
16）將玻片置于SSC中2次，每次5分鐘以去除封片；
17)PBS清洗3分鐘；
18)RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分鐘；
19)PBS清洗5分鐘；
20）室溫，2*SSC清洗10分鐘；
21)37℃，1*SSC清洗10分鐘；
22)37℃，0.5*SSC清洗10分鐘；
23）緩沖液A孵育10分鐘；
24）緩沖液A(1%正常綿羊血清和0.03%三重氫核X-100)孵育30分鐘；
25）加入抗地高辛抗體（1/200的上述緩沖液，來(lái)自Boehringer Mannheim）,37℃孵育3 小時(shí)；
26）緩沖液A清洗2次，每次10分鐘；
27）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
28）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可延長(zhǎng)到16小時(shí)；
29）停止緩沖液B的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗；
30）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。
2、使用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行石蠟切片的原位DNA雜交第一天
1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
2） 無(wú)水乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
3) 95%乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
4) PBS清洗5分鐘；
5) 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
6) PBS清洗5分鐘；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分鐘；
8) PBS清洗2次，每次5分鐘；
9) 0.2N的HCl孵育30分鐘；
10)PBS清洗2次，每次5分鐘；
11)0.25%無(wú)水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
12)PBS清洗5分鐘；
13）預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘；
14）準(zhǔn)備寡核苷酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針；
15）雜交；第二天
16）將玻片置于SSC中以去除封片；
17）室溫，2*SSC清洗10分鐘；
18)37℃，1*SSC清洗10分鐘；
19)37℃，0.5*SSC清洗10分鐘；
20）緩沖液A孵育10分鐘；
21）緩沖液A孵育30分鐘；
22）加入抗地高辛抗體37℃孵育3小時(shí)；
23）緩沖液A清洗2次，每次5分鐘；
24）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
25）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可長(zhǎng)到16小時(shí)；
26）停止緩沖液B的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗；
27）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。
3.原位雜交的介紹
原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。另有熒光原位雜交。
4.原位雜交的原位雜交試驗(yàn)
收集斑馬魚(yú)的胚胎，在Holfretor水中培養(yǎng)，到達(dá)所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí)，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時(shí)后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C 保存，待用（兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。
或者使用苯锍脲稀溶液培養(yǎng)，可阻斷色素的形成） 1. 重新水化和固定1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘。2） 置換成30%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復(fù)一次4） 置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定（本實(shí)驗(yàn)不做此步）1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理，5體節(jié)到24小時(shí)的胚胎處理3分鐘，24小時(shí)以上的胚胎處理5分鐘或者更長(zhǎng)。
發(fā)育時(shí)間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時(shí)間長(zhǎng)的胚胎就需要用蛋白酶來(lái)疏松組織，以便于雜交。2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
2. 預(yù)雜交1）每個(gè)管中置換成大約300ulHYB-溶液，60℃水浴5分鐘，避免振蕩。2）用等體積的HYB+取代HYB-。
3)60℃水浴，預(yù)雜交4小時(shí)以上。3. 雜交1）吸去預(yù)雜交的HYB+，加上100ul已加入探針的HYB+溶液（探針濃度約為1ng/ul）..2)60℃ 溫浴過(guò)夜。
注：雜交與預(yù)雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結(jié)合越好，溫度越高，背景越小。 1.1）將探針回收，放于-20C保存（通常探針可重復(fù)使用十次左右）。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。3）置換2XSSCT1ml,60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml,60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。2.1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dòng)。
2）室溫下加1ml 1:2:7溶液，時(shí)間為一小時(shí)。3）按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰箱過(guò)夜。
1） 用1ml含10%熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時(shí)以上，最后用1mlMABT溶液置換，25分鐘。2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘。
3）將胚胎轉(zhuǎn)入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動(dòng)，室溫下顯色。4）每隔一小時(shí)觀察胚胎是否開(kāi)始顯色5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。
6)4C冰箱保存。原位雜交中溶液的配制：PBS:NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g DEPC H2O 1L HCl 調(diào)PH值至7.4 抽濾，滅菌4% 多聚甲醛：多聚甲醛 40g PBS 1L 加熱持續(xù)攪拌至溶液澄清。
-20℃保存 PBST:PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0.1%。20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2g NaCl 175.5g DEPC H2O 至1L 抽濾，滅菌 SSCT:SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB-：甲酰胺：20XSSC儲(chǔ)液：DEPC水=2:1:1配制 加入Tween-20使其終濃度為0.1%,-20c保存。HYB+:HYB- 20ml yeast RNA 10mg heparin 1mg。
-20℃保存。MAB:maleic acid 11.6g NaCl 8.8g 用固體NaOH（約7g）調(diào)至Ph=7.54℃保存 MABT MAB加上Tween-20使其終濃度為0.1%.10% blocking reagent:blocking reagent 8g MAB 72ml1:2:7溶液：滅活羊血清：10% BM blocking reagent:MABT=1:2:7 用時(shí)現(xiàn)配 Staining buffer:Tris 12.1g pH9.5 Mgcl 6H2O 10.2g,Nacl 5.85g Tween-20 1ml，用之前加1M的左旋咪唑儲(chǔ)液，使之終濃度為1mM。
5.誰(shuí)知道原位雜交怎么做
原位雜交是在分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，是在研究生物體發(fā)育過(guò)程中的一種極為重要的分子遺傳學(xué)的研究方法。其英文名為in situ hybridization，其中in situ為拉丁文，原義是"in its natural position". 字面的意思理解就是說(shuō)在其原來(lái)的天然的位置處雜交。原位雜交主要是基于以下這個(gè)主要原理：?jiǎn)捂湹腄NA或者RNA只要他們的序列是互補(bǔ)的，即符合AT,CG的堿基配對(duì)原則，那么這樣的兩條核酸鏈之間（DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA）就可以形成一個(gè)穩(wěn)定的雜交復(fù)合體。這一原理對(duì)于檢測(cè)一個(gè)特異的mRNA在某一種生物體，或者某些組織切片、單個(gè)細(xì)胞里具體表達(dá)位置非常有用。該技術(shù)最早應(yīng)用于60年代末期，由于核酸分子雜交的特異性高，并可精確定位，因此該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，例如與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交以觀察該組織細(xì)胞中特定基因表達(dá)水平。原位雜交能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對(duì)于那些細(xì)胞數(shù)量少且散在于其他組織中的細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA研究更為方便；同時(shí)由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。
核酸原位雜交可根據(jù)其檢測(cè)物而分為細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)其所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA雜交。但不論哪種雜交都必須經(jīng)過(guò)組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交，雜交，沖等一系列洗步驟及放射自顯影或免疫酶法顯色以顯示雜交結(jié)果。
我們?cè)谶@兒介紹的是整胚原位雜交，不同于一般的在載片上對(duì)細(xì)胞和組織切片進(jìn)行探針雜交及檢測(cè)的原位雜交，而是對(duì)完整的斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行探針雜交及檢測(cè)，從整體上把握探針的結(jié)合部位，然后對(duì)胚胎進(jìn)行切片，以確定探針結(jié)合的具體位置。整胚原位雜交在斑馬魚(yú)分子生物學(xué)研究中是一種非常重要的實(shí)驗(yàn)方法，原位雜交的探針可以是同位素的探針，用放射自顯影來(lái)檢測(cè)；也可以是非同位素的探針，通過(guò)熒光或酶法予以檢測(cè)。我們這兒所介紹的一種原位雜交的方法是通過(guò)后者，以地高辛標(biāo)記探針，然后用酶聯(lián)抗體的方法進(jìn)行檢測(cè)。
原位雜交（In situ hybridazation）
固定
收集斑馬魚(yú)的胚胎，在Holfretor水中培養(yǎng)，到達(dá)所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí)，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時(shí)后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C 保存，待用（兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培養(yǎng)，可阻斷色素的形成）
6.RNA熒光原位雜交
原位雜交：在研究DNA分子復(fù)制原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)。
其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過(guò)氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子的特點(diǎn)，應(yīng)帶有標(biāo)記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)）DAN或 RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸。（RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DAN 的存在與定位；用原位雜交術(shù)，可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。
此方法有很高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水來(lái)探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)。
