一、常用的染色方法有革蘭氏染色(最基本)、芽孢染色、莢膜染色、鞭毛染色等。
二、.1 革蘭染色法 (1)取含金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的混合菌液涂片、干燥、固定;(2)染色:用結(jié)晶紫染液染1min,水沖洗;盧戈碘液染1min,水沖洗;0.4%復(fù)紅酒精溶液染30s,水沖洗;(3)吸干后鏡檢[2] 。
1.2 抗酸染色法 (1)取結(jié)核桿菌陽(yáng)性的痰標(biāo)本(已處理)涂片、干燥、固定。(2)染色:將石炭酸復(fù)紅染液沸水浴10min,滴加2~3滴覆蓋菌膜染色 5min,水沖洗,3%鹽酸酒精脫色30s,水沖洗;堿性美蘭復(fù)染30s,水沖洗。(3)吸干后鏡檢[3] 。
1.3 莢膜染色法 (1)取接種肺炎球菌死亡的小鼠腹腔液涂片、干燥、固定;(2)染色:用石炭酸復(fù)紅染液染1min,水沖洗;95%酒精脫色5s水沖洗;20%鞣酸溶液媒染10min水沖洗;0.8%孔雀綠溶液染色1min,水沖洗;(3)吸干后鏡檢[4] 。
1.4 芽胞染色法 (1)取等量破傷風(fēng)桿菌厭氧培養(yǎng)菌液和5%孔雀綠水溶液,放入小試管中充分混合,沸水浴20min;取上述混合液涂片、干燥、固定;(2)用 1%沙黃液復(fù)染10min,水沖洗;(3)干后鏡檢。
2.1 革蘭染色 鏡下,金黃色葡萄球菌染成紫色、球形,為革蘭陽(yáng)性菌;大腸埃希菌染成紅色、桿狀,為革蘭陰性菌。革蘭染色法是細(xì)菌學(xué)中最經(jīng)典,應(yīng)用最廣泛的染色法之一。脫色是影響革蘭染色的關(guān)鍵步驟,脫色時(shí)間長(zhǎng)短直接關(guān)系到染色結(jié)果的準(zhǔn)確性[5] 。脫色過度則革蘭陽(yáng)性菌可能被誤染為革蘭陰性菌,脫色不 夠則革蘭陰性菌可能被誤染為革蘭陽(yáng)性菌,為此學(xué)生難以把握?,F(xiàn)將原有四步染色法改為三步法,即把第三步酒精脫色和第四步復(fù)紅復(fù)染合并一步進(jìn)行,使用 0.4%復(fù)紅酒精溶液作為復(fù)染劑,可達(dá)到脫色和復(fù)染雙重目的。這樣,就可以避免學(xué)生在四步法中因脫色時(shí)間不易掌握而造成染色的失敗,減少重復(fù)性實(shí)驗(yàn),提高了教學(xué)效果。
2.2 抗酸染色 鏡下,結(jié)核分枝桿菌染成紅色,為抗酸菌;背景和其他菌被染成藍(lán)色,為非抗酸菌。傳統(tǒng)的方法是滴加石炭酸復(fù)紅染液于涂片上,用玻片夾夾住涂片以微火煙葉熱,保持染液冒蒸汽約5min,此法學(xué)生容易使染液蒸干或使染液沸騰,從而影響染色效果和污染環(huán)境。改良后的方法是將染液直接加熱改為水浴后使用,克服上述的缺點(diǎn),且染色效果良好。適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)使用。
2.3 莢膜染色 鏡下,肺炎球菌菌體染成紅色(成雙排列),莢膜染成綠色,存在于菌體的周圍。傳統(tǒng)的莢膜染色是用結(jié)晶紫染液染色,菌體染成紫色,莢膜染成淡紫色或無(wú)色,菌體和莢膜之間反差小,不易分辨。改良后,增加了脫色、媒染、復(fù)染的步驟,使菌體和莢膜之間反差增大,易于觀察,可用于學(xué)生實(shí)驗(yàn)和示教片的制作。
2.4 芽胞染色 鏡下,破傷風(fēng)桿菌的菌體染成紅色,芽胞染成綠色。傳統(tǒng)的方法是滴加石炭酸復(fù)紅染液于涂片上并弱火加熱,使染液冒蒸汽約5min,此法染液用量大,且容易污染衣物和實(shí)驗(yàn)臺(tái)。現(xiàn)改為菌液和染液混合水浴加熱初染,然后制備涂片、固定、復(fù)染,即節(jié)約時(shí)間,染液消耗又少,且菌體、芽胞對(duì)比鮮明。此法適用于教學(xué)標(biāo)本片的制作。
三、簡(jiǎn)單染色法是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。
操作步驟
1.涂片:用灼燒滅菌冷卻后的接種環(huán)挑取少量菌體與水滴充分混勻,涂成極薄的菌膜。
2.干燥:可自然晾干,或?qū)⑼科糜诨鹧娓咛幬岷娓桑荒苤苯釉诨鹧嫔虾婵尽?/p>
3.固定:手執(zhí)玻片一端,有菌膜的一面朝上,通過迅速通過火焰2-3次(用手指觸涂片反面,以不燙手為宜)。
4.染色:加適量(以蓋滿菌膜為度)結(jié)晶紫染色液(或石炭酸復(fù)紅液),染l~2min。
5.水洗:用自來沖洗至流下的水中無(wú)染色液的顏色時(shí)為止。
6.干燥
7.鏡檢
1 革蘭氏染色法 是最常用的鑒別染色法之一。此法起始1881年,染色步驟是先用結(jié)晶紫或龍膽紫染液加于已固定好的標(biāo)本上使之著色,其后加碘液作媒染劑,再用酒精脫色,最后用復(fù)紅或沙黃復(fù)染。革蘭氏染色的結(jié)果與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及操作技術(shù)等有密切關(guān)系。如涂片太厚影響酒精脫色,革蘭氏陰性菌則可染成革蘭氏陽(yáng)性菌。脫色時(shí)若酒精作用時(shí)間太長(zhǎng), ,莢膜不著色,包繞在菌體周圍,成為一層透明的空圈。 5 熒光染色法 用熒光染料,如金胺、吖啶橙等進(jìn)行染色。細(xì)菌用熒光染料著色后在熒光顯微鏡下檢查,可在黑的背景中觀察到細(xì)菌發(fā)出明亮的熒光。用熒光染色法檢查細(xì)菌,有加快檢查速度和提高陽(yáng)性率等優(yōu)點(diǎn)。
給細(xì)菌染色的方法都有幾種,怎么操作,都用復(fù)紅染色
簡(jiǎn)單染色法:利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法.例如番紅.
1.涂片:用灼燒滅菌冷卻后的接種環(huán)挑取少量菌體與水滴充分混勻,涂成極薄的菌膜.
2.干燥:可自然晾干,或?qū)⑼科糜诨鹧娓咛幬岷娓桑荒苤苯釉诨鹧嫔虾婵?
3.固定:手執(zhí)玻片一端,有菌膜的一面朝上,通過迅速通過火焰2-3次(用手指觸涂片反面,以不燙手為宜).
4.染色:加適量(以蓋滿菌膜為度)結(jié)晶紫染色液(或石炭酸復(fù)紅液),染l~2min.
5.水洗:用自來沖洗至流下的水中無(wú)染色液的顏色時(shí)為止.
6.干燥
7.鏡檢
復(fù)染色:利用用兩種以上染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色.例如革蘭氏染色法.
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟,需要堿性染料(basic dye)初染液;媒染劑(mordant);脫色劑(decolorising agent)和復(fù)染液(counterstain).
堿性染料初染液的象在細(xì)菌的單染色法基本原理中所述的那樣,而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫(crystal violet).媒染劑的作用是增加染料和細(xì)胞之間的親和性或附著力,即以某種方式幫助染料固定在細(xì)胞上,使不易脫落,碘(iodine )是常用的媒染劑.脫色劑是將被染色的細(xì)胞進(jìn)行脫色,不同類型的細(xì)胞脫色反應(yīng)不同,有的能被脫色,有的則不能,脫色劑常用95%的酒精(ethanol).復(fù)染液也是一種堿性染料,其顏色不同于初染液,復(fù)染的目的是使被脫色的細(xì)胞染上不同于初染液的顏色,而未被脫色的細(xì)胞仍然保持初染的顏色,而且將細(xì)胞區(qū)分成G+和G-兩大類群,常用的復(fù)染液為番紅.
1.載玻片固定.在無(wú)菌操作條件下,用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌于干凈的載玻片上涂布均勻,在火焰上加熱以殺死菌種并使其粘附固定.
2.草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘.
3.自來水沖洗,去掉浮色.
4.用碘-碘化鉀溶液媒染1分鐘,傾去多余溶液.
5.用中性脫色劑如乙醇(95%)或丙酮酸脫色30秒,革蘭氏陽(yáng)性菌不被褪色而呈紫色,革蘭氏陰性菌被褪色而呈無(wú)色.
6.用番紅染液或者沙黃復(fù)染30秒,革蘭氏陽(yáng)性菌仍呈紫色,革蘭氏陰性菌則呈現(xiàn)紅色.
常用的細(xì)菌染色方法有簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色。1、簡(jiǎn)單染色是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色,常用堿性染料如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。方法很簡(jiǎn)單:(一)制片:進(jìn)行無(wú)菌涂片->;自然風(fēng)干->;微火固定 (二)染色:例如用美藍(lán)染色3-5分鐘,濾紙吸干后就可以置于顯微鏡下觀察了
2、革蘭氏染色:使用非常普遍。方法:(1)用堿性染料結(jié)晶紫對(duì)菌液涂片進(jìn)行初染(2)用碘液進(jìn)行媒染(3)用乙醇沖洗以脫色(4)用一種與結(jié)晶紫不同顏色的堿性染料進(jìn)行復(fù)染如沙黃。
這些實(shí)驗(yàn)都很簡(jiǎn)單,到時(shí)候你親自做一遍就會(huì)很明白了,你現(xiàn)在只需弄清原理和簡(jiǎn)單過程就行。
質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì),多為環(huán)狀雙螺旋DNA分子。
質(zhì)??梢宰陨韽?fù)制,質(zhì)粒是自行復(fù)制單位,有的需與核質(zhì)染色體的復(fù)制同步,稱為嚴(yán)緊型復(fù)制(stringent replication)。 質(zhì)粒編碼細(xì)菌各種重要的生物學(xué)性狀。
編碼性菌毛的質(zhì)粒稱致育質(zhì)粒或F質(zhì)粒(fertility plasmid),具有F質(zhì)粒的細(xì)菌有性菌毛。編碼細(xì)菌各種毒力因子的質(zhì)粒統(tǒng)稱毒力質(zhì)?;颌鲑|(zhì)粒(virulence plasmid),如致病性大腸桿菌在黏膜上定居及產(chǎn)生毒素的能力可由不同質(zhì)粒編碼,其中K質(zhì)粒編碼對(duì)黏膜具有黏附活性的菌毛,ST質(zhì)粒與LT質(zhì)粒分別編碼耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素。
細(xì)菌對(duì)抗菌藥物或重金屬鹽類的抗性則由R質(zhì)粒(resistance plasmid)所決定。一個(gè)質(zhì)??赏瑫r(shí)具有幾種編碼功能。
有的質(zhì)粒還可以結(jié)合到染色體上,如F質(zhì)粒在變形桿菌內(nèi)是獨(dú)立存在的,但在大腸桿菌內(nèi)則可與染色體結(jié)合,這種質(zhì)粒稱為附加體(episome)。 轉(zhuǎn)座因子 (transposable element)近年來發(fā)現(xiàn)微生物的某些DNA片段作為一個(gè)獨(dú)立單位可在染色體上移動(dòng),此種移動(dòng)甚至可發(fā)生在不同種細(xì)胞之間。
這種可移動(dòng)的DNA片段稱之為轉(zhuǎn)座因子。細(xì)菌的轉(zhuǎn)座因子有三種類型:插入序列(insert sequence,IS)、轉(zhuǎn)座子(transposon,Tn)以及某些特殊的噬菌體。
毒力島 (pathogen。質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì),多為環(huán)狀雙螺旋DNA分子。
質(zhì)??梢宰陨韽?fù)制,質(zhì)粒是自行復(fù)制單位,有的需與核質(zhì)染色體的復(fù)制同步,稱為嚴(yán)緊型復(fù)制(stringent replication)。 質(zhì)粒編碼細(xì)菌各種重要的生物學(xué)性狀。
編碼性菌毛的質(zhì)粒稱致育質(zhì)?;騀質(zhì)粒(fertility plasmid),具有F質(zhì)粒的細(xì)菌有性菌毛。編碼細(xì)菌各種毒力因子的質(zhì)粒統(tǒng)稱毒力質(zhì)?;颌鲑|(zhì)粒(virulence plasmid),如致病性大腸桿菌在黏膜上定居及產(chǎn)生毒素的能力可由不同質(zhì)粒編碼,其中K質(zhì)粒編碼對(duì)黏膜具有黏附活性的菌毛,ST質(zhì)粒與LT質(zhì)粒分別編碼耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素。
細(xì)菌對(duì)抗菌藥物或重金屬鹽類的抗性則由R質(zhì)粒(resistance plasmid)所決定。一個(gè)質(zhì)粒可同時(shí)具有幾種編碼功能。
有的質(zhì)粒還可以結(jié)合到染色體上,如F質(zhì)粒在變形桿菌內(nèi)是獨(dú)立存在的,但在大腸桿菌內(nèi)則可與染色體結(jié)合,這種質(zhì)粒稱為附加體(episome)。 轉(zhuǎn)座因子 (transposable element)近年來發(fā)現(xiàn)微生物的某些DNA片段作為一個(gè)獨(dú)立單位可在染色體上移動(dòng),此種移動(dòng)甚至可發(fā)生在不同種細(xì)胞之間。
這種可移動(dòng)的DNA片段稱之為轉(zhuǎn)座因子。細(xì)菌的轉(zhuǎn)座因子有三種類型:插入序列(insert sequence,IS)、轉(zhuǎn)座子(transposon,Tn)以及某些特殊的噬菌體。
毒力島 (pathogenicity island,PAl)是20世紀(jì)90年代提出的一個(gè)新概念。PAI指病原菌的某個(gè)或某些毒力基因群,分子結(jié)構(gòu)與功能有別于細(xì)菌染色體,但位于細(xì)菌染色體之內(nèi),因此稱之為‘島”。
PAI雖然是染色體的DNA片段,但兩端往往具有重復(fù)序列與插入元件,其G+C%及密碼使用與細(xì)菌染色體有明顯差異,分子量多為30~40kb,也有達(dá)100kb者。
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