核酸分子的標記方法(有幾種核酸標記的方法)

1.有幾種核酸標記的方法

通過核酸標記技術(shù)可將細胞因子cDNA作為基因探釗檢測細胞內(nèi)細胞因子 基因組 DNA或mRNA。主要有以下幾種方法：

1.應(yīng)用同位素（或非同位素）標記的cDNA探針，檢測經(jīng)Northern blot后細胞因子mRNA水平或采用打點雜交法。

2.應(yīng)用標記cDNA探釗與細胞或組織切片進行原位雜交，然后進行放射自顯影。

3.細胞因子mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異性細胞因子引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增細胞因子cDNA,Southern blot后用標記探針檢測特異細胞因子DNA水平。

2.分子標記的方法有哪些

一、基于分子雜交技術(shù)的分子標記技術(shù) 此類標記技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶解及凝膠電泳分離不同的生物 DNA 分子，然后用經(jīng)標記的特異 DNA 探針與之進行雜交，通過放射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示 DNA 的多態(tài)性。

① 限制性片段長度多態(tài)性 （Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP） 1974年Grodzicker等創(chuàng)立了限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)，它是一種以DNA—DNA雜交為基礎(chǔ)的第一代遺傳標記。RFLP基本原理：利用特定的限制性內(nèi)切酶識別并切割不同生物個體的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，所產(chǎn)生的DNA數(shù)目和各個片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布情況。

通過凝膠電泳分析這些片段，就形成不同帶，然后與克隆DNA探針進行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。它所代表的是基因組DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生片段在長度上差異。

由于不同個體的等位基因之間堿基的替換、重排、缺失等變化導致限制內(nèi)切酶識別和酶切發(fā)生改變從而造成基因型間限制性片段長度的差異。 RFLP的等位基因其有共顯性特點。

RFLP標記位點數(shù)量不受限制，通?？蓹z測到的基因座位數(shù)為1—4個。RFLP技術(shù)也存在一些缺陷，主要是克隆可表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難；另外，實驗操作較繁鎖，檢測周期長，成本費用也很高。

自RFLP問世以來，已經(jīng)在基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、疾病的基因診斷等研究中仍得到了廣泛的應(yīng)用。② 數(shù)目可變串聯(lián)重復多態(tài)性 （Variable Number of Tandem Repeats,VNTR） 數(shù)目可變串聯(lián)重復序列又稱小衛(wèi)星DNA (Minisatellite DNA)，是一種重復DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數(shù)10一10001不等。

VNTR基本原理與RFLP大致相同，只是對限制性內(nèi)切酶和DNA探針有特殊要求：（1）限制性內(nèi)切酶的酶切位點必須不在重復序列中，以保證小衛(wèi)星或微衛(wèi)星序列的完整性。（2）內(nèi)切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點，則可使衛(wèi)星序列所在片段含有較少無關(guān)序列，通過電泳可充分顯示不同長度重復序列片段的多態(tài)性。

（3）分子雜交所用DNA探針核昔酸序列必須是小衛(wèi)星序列或微衛(wèi)星序列，通過分子雜交和放射自顯影后，就可一次性檢測到眾多小衛(wèi)星或微衛(wèi)星位點，得到個體特異性的DNA指紋圖譜。 小衛(wèi)星標記的多態(tài)信息含量較高，在17一19之間。

缺點是數(shù)量有限，而且在基因組上分布不均勻，這就極大限制其在基因定位中的應(yīng)用。VNTR也存在實驗操作繁瑣、檢測時間長、成本高的缺點。

編輯本段二、基于PCR技術(shù)的分子標記技術(shù) （一）、隨機引物的PCR標記 所用引物的核苷酸序列是隨機的，其擴增的 DNA 區(qū)域事先未知。隨機引物PCR擴增的 DNA 區(qū)段產(chǎn)生多態(tài)性的分子基礎(chǔ)是模板 DNA 擴增區(qū)段上引物結(jié)合位點的堿基序列的突變，不同來源的基因組在該區(qū)段上表現(xiàn)為擴增產(chǎn)物有無差異或擴增片段大小的差異。

隨機引物PCR標記表現(xiàn)為顯性或共顯性。① 隨機擴增多態(tài)性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD) RAPD技術(shù)是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技術(shù)發(fā)展的檢測DNA多態(tài)性的方法。

基本原理：它是利用隨機引物（一般為8—10bp）通過PCR反應(yīng)非定點擴增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。擴增片段多態(tài)性便反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。

RAPD所使用的引物各不相同，但對任一特定引物，它在基因組DNA序列上有其特定的結(jié)合位點，一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DAN片段插人、缺失或堿基突變，就可能導致這些特定結(jié)合位點的分布發(fā)生變化，從而導致擴增產(chǎn)物數(shù)量和大小發(fā)生改變，表現(xiàn)出多態(tài)性。就單一引物而言，其只能檢測基因組特定區(qū)域DNA多態(tài)性，但利用一系列引物則可使檢測區(qū)域擴大到整個基因組，因此，RAPD可用于對整個基因組DNA進行多態(tài)性檢測，也可用于構(gòu)建基因組指紋圖譜。

與RFLP相比，RAPD具有以下優(yōu)點：（1）技術(shù)簡單，檢測速度快；（2） RAPD分析只需少量DNA樣品；（3）不依賴于種屬特異性和基因組結(jié)構(gòu)，一套引物可用于不同生物基因組分析；（4）成本較低。但RAPD也存在一些缺點：（1） RAPD標記是一個顯性標記，不能鑒別雜合子和純合子；（2）存在共遷移問題，凝膠電泳只能分開不同長度DNA片段，而不能分開那些分子量相同但堿基序列組成不同的DNA片段；（3） RAPD技術(shù)中影響因素很多，所以實驗的穩(wěn)定性和重復性差。

② 任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction, AP—PCR) 在AP—PCR分析中，所使用的引物較長（10-50 bp） , PCR反應(yīng)分為兩個階段，首先寡核昔酸引物在低嚴謹條件下與模板DNA退火，此時發(fā)生了一些合成，以便穩(wěn)定模板與引物之間相互作用。然后進行高嚴謹退火條件的循環(huán)，兩個位點間那些序列在低嚴謹度退火條件下發(fā)生的引物延伸可繼續(xù)在高嚴謹條件下擴增。

采用變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，最終反應(yīng)結(jié)果與RAPD類似。只要設(shè)計的引物在低嚴謹退火條件下能減少引物產(chǎn)生人為產(chǎn)物，應(yīng)用成對。

3.分子標記方法

分子標記 在農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究領(lǐng)域，分子標記技術(shù)已開始應(yīng)用于作物種質(zhì)資源和育種的研究，特別是在構(gòu)建分子遺傳圖譜和標記目的性狀基因方面取得了很大的進展。

形態(tài)標記（morphologica markers）即植物的外部特征特性，如株高、穗長、粒色、千粒重等。此種形態(tài)標記簡單直觀，但是形態(tài)標記數(shù)少、多態(tài)性差、易受環(huán)境條件影響。

在小麥抗葉銹病基因標記方面，SINGH[5]曾利用形態(tài)標記發(fā)現(xiàn)慢葉銹基因Lr34和小麥葉片尖部壞死基因緊密連鎖。 細胞標記（cytological markers）主要是染色體核型（染色體鼠數(shù)目、大小、隨體、著絲點位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等），這類標記的缺點是數(shù)目有限。

目前，還未發(fā)現(xiàn)用其進行小麥抗葉銹基因的標記。 生化標記（biochemical markers）主要包括同工酶和儲藏蛋白。

生化標記具有經(jīng)濟方便的優(yōu)點，但其標記數(shù)有限。DAVlD[6]等曾利用生化標記內(nèi)肽酶同工酶EP-Dld作為遺傳標記對以Thatcher為背景的小麥抗葉銹病近等基因系進行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)EP-Dld與Lr19緊密連鎖，重組值為（0.01士0.09）個作圖單位。

WINZELER[7]等利用含Lr19的小麥抗葉銹病近等基因系，發(fā)現(xiàn)生化標記內(nèi)肽酶同工酶EP-Dl的無效等位基因EP-Dlc可以作為與 Lr19緊密連鎖的生化標記，遺傳距離為（0.33士0.33）cM。 分子標記與形態(tài)標記、細胞標記、生化標記相比較，有以下幾方面的優(yōu)點：①在植物體的多個組織及生育階段均可檢測到，不受時空限制。

②數(shù)量多，遍及整個基因組。③有許多標記表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別基因型純合與否，提供完整的基因型。

在標記小麥抗葉銹病基因方面，分子標記可以在更深層次上揭示小麥抗銹遺傳機制。通過找到與抗銹基因緊密連鎖的分子標記，不但能在遺傳背景不同的育種材料中特異性的檢測目的基因，而且可以在任一生育階段同時對多個抗性基因進行篩選，這為了解抗源和抗病品種中所含有的抗性基因提供了更為迅速、穩(wěn)定、可靠的方法。

目前，用于標記小麥抗葉銹病基因的分子標記主要有以下幾種： 2.l RFLP技術(shù)在小麥抗葉銹病基因標記中的應(yīng)用 RFLP(restriction fragment length polymorphism)作為遺傳分析的工具開始于1974年，80年代開始應(yīng)用于植物。其基本原理是物種的基因組DNA在限制性內(nèi)切酶的作用下，產(chǎn)生相當多的、大小不等的DNA片段，用放射性同位素標記的DNA做探針把與被標記DNA相關(guān)的片段檢測出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜；它所代表的是基因組 DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段在長度上的差異。

RFLP技術(shù)被廣泛應(yīng)用于小麥遺傳圖譜的構(gòu)建標記和定位小麥的目的基因。 在小麥抗葉銹病基因的RFLP標記方面，SCHACHERMAYR等[8]將一編碼受體蛋白激酶的Lrkl0基因的3.9Kb的HindⅢ片段用 PstⅠ分成六個亞片段，將這些亞片段作為RFLP標記，尋找到了特異的Lrk10片段可作為與小麥抗葉銹病基因Lr10緊密連鎖的分子標記，將這一亞片段與已知抗性基因的單基因系進行Southern雜交，發(fā)現(xiàn)這一3.9Kb的HindⅢ片段僅存在于攜帶抗葉銹病基因Lr10的近等基因系中。

進一步將此 RFLP標記Krkl0-6轉(zhuǎn)變?yōu)镾TS標記STSLrkl0一6，發(fā)現(xiàn)一282bp的片段僅存在于攜帶Lr10的品種中，F(xiàn)2群體分離進一步證明此 282bp的片段與Lr10緊密連鎖。SCHACHERMAYR等[9]利用近等基因系找到了與抗葉銹病基因Lr24緊密連鎖的RFLP和RAPD的標記。

在供試的115個RFLP探針中，其中6個與Lr24緊密連鎖，從360個隨機RAPD引物中，找到了11個能夠揭示多態(tài)性的引物，其中一個與 Lr24緊密連鎖，并將該RAPD產(chǎn)物克隆、測序?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定可靠的STS標記，為分子標記輔助育種打下了良好的基礎(chǔ)。FEUILLET等[10] 利用小麥抗葉銹病近等基因系Lr1/6*Thatcher和Thatcher及感病品種Frisal，通過F2群體分離，將37個RFLP中的16個定位在了第五部分同源群，而且能在Lr1/6*Thatcher和Frisal之間揭示多態(tài)性，I1個RFLP探針能在近等基因系間揭示多態(tài)性，F(xiàn)2群體分離分析發(fā)現(xiàn)，其中3個與抗性基因連鎖，其中一定位在染色體5D上的探針pTAG621證明與Lr1緊密連鎖，并將這一RFLP標記轉(zhuǎn)化為了更為可靠的STS 標記。

AUTRIQUE[11]等利用4種含不同抗性基因的小麥近等基因系，根據(jù)抗性基因在其染色體上所處的位置選擇克隆，同時，從大麥的RFLP連鎖圖譜和D一基因組RFLP圖譜中，挑選了其它的克隆。通過雜交的方法來尋找多態(tài)性分子標記。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，定位在染色體7DL和3DL上的8個分子標記，與抗性基因Lr19和Lr24共分離；來自Aegilops umbellulata的Lr9，被定位在染色體6B上，一克隆XksuD27與Lr9共分離，以及與Lr32緊密連鎖的兩個RFLP標記，遺傳距離分別為（3.3土2.6）cM和（6.9土3.6）cM。 2.2 小麥抗葉銹病基因的RAPD標記 NAIK等[12]利用含Lr28的抗葉銹病近等基因系，從80個隨機引物中找到了一個能在供體親本和輪回親本中揭示多態(tài)性的RAPD標記OPJ一 O1。

將此387bp的多態(tài)性產(chǎn)物克隆、測序，將其設(shè)計成更為穩(wěn)定的STS標記，利用BSA法，對F3群體進行分析，發(fā)現(xiàn)387bp的特異性產(chǎn)物只出現(xiàn)在抗性群體中，而在感病群體中表現(xiàn)缺失。證明了RAPD標記OPJ一O1和STS 。

4.DNA分子標記的種類有哪些,各有何特點

主要介紹以下四種：1 RFLP ：該技術(shù)由Grodzicker等于1974年創(chuàng)立特定生物類型的基因組DNA經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全酶解后，會產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段RFLP標記技術(shù)的基本原理就是通過電泳的方法分離和檢測這些片段凡是可以引起酶解位點變異的突變，如點突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化）等均可導致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生RFLP該技術(shù)包括以下基本步驟：DNA提取；用DNA限制性內(nèi)切酶消化；凝膠電泳分離限制性片段；將這些片段按原來的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上；用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱 Southern雜交）；放射性自顯影或酶學檢測顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態(tài)性 RFLP標記的主要特點有：（1）遍布于整個基因組，數(shù)量幾乎是無限的；（2）無表型效應(yīng)，不受發(fā)育階段及器官特異性限制；（3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；（4）結(jié)果穩(wěn)定可靠；（5）DNA需要量大，檢測技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實踐中2 RAPD ：由Williams等于1990年創(chuàng)立其基本原理與PCR技術(shù)一致 PCR技術(shù)是一種體外快速擴增特異基因或DNA序列的方法，由Mullis等于1985年首創(chuàng)該技術(shù)在試管中建立反應(yīng)體系，經(jīng)數(shù)小時后，就能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍其原理與細胞內(nèi)發(fā)生的DNA復制過程相類似，首先是雙鏈DNA分子在鄰近沸點的溫度下加熱時便分離成兩條單鏈DNA分子，然后DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互補鏈，以上過程為一個循環(huán)，每一個循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板，經(jīng)過20-30個循環(huán)后，介于兩個引物間的特異DNA片段以幾何數(shù)得以大量復制 RAPD標記技術(shù)就是用一個（有時用兩個）隨機引物（一般8-10個堿基）非定點地擴增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴增片段遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入缺失或堿基突變，就有可能導致引物結(jié)合位點的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導致PCR產(chǎn)物增加缺少或發(fā)生分子量變化若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標記 RAPD標記的主要特點有：（1）不需DNA探針，設(shè)計引物也無須知道序列信息；（2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術(shù)簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)；（4）DNA樣品需要量少，引物價格便宜，成本較低；（5）實驗重復性較差，結(jié)果可靠性較低 3 AFLP ：由Zabeau和Vos于1993年發(fā)明AFLP標記是選擇性擴增基因組DNA酶切片段所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物的多態(tài)性，其實質(zhì)也是顯示限制性內(nèi)切酶酶切片段的長度多態(tài)性，只不過這種多態(tài)性是以擴增片段的長度不同被檢測出來該技術(shù)結(jié)合了RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術(shù)的簡便高效性，同時又能克服RFLP帶型少信息量小以及RAPD技術(shù)不穩(wěn)定的缺點其基本技術(shù)原理和操作步驟如下：首先用限制性內(nèi)切酶酶解基因組DNA，形成許多大小不等的隨機限制性片段；接著在這些片段的兩端連接上特定的寡聚核苷酸接頭（Oligo nuleotide adapter）；然后根據(jù)接頭序列設(shè)計引物，由于限制性片段太多，全部擴增則產(chǎn)物難以在膠上分開，為此在引物的3端加入1-3個選擇性堿基，這樣只有那些能與選擇性堿基配對的片段才能與引物結(jié)合，成為模板被擴增，從而達到對限制性片段進行選擇擴增的目的；最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，將這些特異性的擴增產(chǎn)物分離開來 AFLP標記的主要特點有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性內(nèi)切酶及選擇性堿基種類數(shù)目很多，所以該技術(shù)所產(chǎn)生的標記數(shù)目是無限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反應(yīng)產(chǎn)物的譜帶在50-100條之間，所以一次分析可以同時檢測到多個座位，且多態(tài)性極高；（3）表現(xiàn)共顯性，呈典型孟德爾式遺傳；（4）分辯率高，結(jié)果可靠；（5）目前該技術(shù)受專利保護，用于分析的試劑盒昂貴，實驗條件要求較高 4 SSR(SSLP) ：由Moore等于1991年創(chuàng)立SSR即微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個（多為1-5個）堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復而成的DNA序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n(AT)n(GGC)n等重復不同遺傳材料重復次數(shù)的可變性，導致了SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標記產(chǎn)生的基礎(chǔ)盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計一對特異引物，通過PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴增出來，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長度多態(tài)性，即SSR標記 SSR標記的主要特點有：（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因組；（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實驗重復性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標記時需知道重復序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費用也較高.。

5.DNA分子標記技術(shù)有哪幾類要說出它們各

分子標記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)， 大致可分為三大類。

第一類是以分子雜交為核心的分子標記技術(shù)， 包括：（1） 限制性片段長度多態(tài)性標記（Restriction fragment length polymorphism， 簡稱 RFLP 標記）； （2） DNA 指紋技術(shù)（DNA Fingerprinting）; (3) 原位雜交（in situ hybridization） 等；

第二類是以 PCR 反應(yīng)為核心的分子標記技術(shù)， 包括：（1） 隨機擴增多態(tài)性 DNA 標記（Random amplification polymorphism DNA， 簡稱 RAPD 標記）； （2） 簡單序列重復標記（Simple sequence repeat， 簡稱 SSR 標記） 或簡單序列長度多態(tài)性（Simple sequence length polymorphism， 簡稱 SSLP 標記）； （3） 擴展片段長度多態(tài)性標記（Amplified fragment length polymorphism， 簡稱 AFLP 標記）； （4） 序標位（Sequence tagged sites， 簡稱 STS 標記）； （5） 序列特征化擴增區(qū)域（Sequence charactered amplified region， 簡稱 SCAR 標記） 等；

第三類是一些新型的分子標記，如： （1） 單核苷酸多態(tài)性（Single nuleotide polymorphism， 簡稱 SNP 標記）； （2） 表達序列標簽（Expressed sequences tags， 簡稱 EST 標記） 等。