引物設(shè)計(jì)參數(shù):
a
引物長(zhǎng)度一般在20bp左右,上下游引物堿基長(zhǎng)度不要相差超過(guò)4個(gè)堿基。
b
引物退火溫度一般在58度,不同軟件TM使用不同的算法,primer3,primer
5,primer
6,primer
express等一般可以設(shè)置在55-58度,beacon
design可以設(shè)置在65左右。
c
GC含量一般沒(méi)什么特殊要求,40-60最好,如果不好設(shè)計(jì),30-80也是可以的。
d
產(chǎn)物長(zhǎng)度在100-150,80-200也可以,不要在50bp左右,那樣和引物二聚體不易區(qū)分,超過(guò)200bp可能會(huì)影響PCR擴(kuò)增效率。
e
軟件給出的引物不能有發(fā)卡結(jié)構(gòu)和超過(guò)3-4個(gè)堿基的匹配,特別是3`端不能有堿基匹配,那樣更容易形成二聚體。
f
引物設(shè)計(jì)好以后,在NCBI上做一個(gè)primer-blast,檢測(cè)一下是否有非特異性擴(kuò)增。
設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:
①引物長(zhǎng)度:15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn), 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn), 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
1、引物長(zhǎng)度一般為15-30bp,常用的為18-27bp,但不能大于38bp;2、引物GC含量一般為40%-60%,以45-55%為宜,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近;3、引物所對(duì)應(yīng)的模板序列的Tm值最好在72℃左右,至少要在55-80℃之間,Tm值曲線以選取72度附近為佳,5'到 3'的下降形狀也有利于引物與模板的結(jié)合;4、ΔG值(自由能)反應(yīng)了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度,3'端的ΔG值相對(duì)要低,且絕對(duì)值不要超過(guò)9,否則不利于正確引發(fā)反應(yīng),3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時(shí),PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百,但在-6時(shí)只達(dá)到40%,-8時(shí)少于20%,-10時(shí)接近于0;5、錯(cuò)配率一般不要超過(guò)100,否則會(huì)出現(xiàn)非目的條帶。
但對(duì)于某些特定的模板序列,還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大,比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為340以上,而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為110,并且不好找到其他更合適的引物,那么這對(duì)引物是可以接受的;6、Frq曲線為Oligo6軟件新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo),解釋了序列片段存在的重復(fù)幾率大小,選取引物時(shí),應(yīng)該用Frq值相對(duì)較低的片段;7、引物二聚體及發(fā)卡結(jié)構(gòu)的能量的絕對(duì)值一般不要超過(guò)4.5,否則容易產(chǎn)生引物二聚體而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR不能正常發(fā)生;8、3'端最好不要是連續(xù)堿基,GGG或CCC會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的引發(fā),同時(shí)3'端最后一個(gè)堿基最好不要是A或T,若是,會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)配;9、以公式Tm=4*(G+C)+2*(A+T)-5計(jì)算Tm值,也就是退火溫度。
選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應(yīng)的退火溫度,最好保證每個(gè)引物的Tm值相匹配,且在70-75℃范圍內(nèi);10、模板與穩(wěn)定性較小的引物之間的Tm的差異越小,PCR的效率越高。因?yàn)榻怄湝囟纫踩Q于它的長(zhǎng)度,如果期待的產(chǎn)物長(zhǎng)度等于或小于500bp,選用端的引物(16-18bp),如果產(chǎn)物長(zhǎng)5kb,則用24bp的引物;11、在DNA測(cè)序和PCR中最好用5'末端穩(wěn)定(GC含量多),而3'端不穩(wěn)定(AT含量多)的引物,這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng);12、引物和產(chǎn)物之間的Tm值相差別太大,20攝氏度范圍內(nèi)最好。
13、對(duì)引物的修飾一般在5'端進(jìn)行,例如加酶切位點(diǎn),加酶切位點(diǎn)的同時(shí)要根據(jù)需要添加保護(hù)堿基。
你首先要明白,引物是什么?為什么要設(shè)計(jì)引物?明白了之后,再去看資料和網(wǎng)上設(shè)計(jì)引物的介紹,一定能明白。
關(guān)于設(shè)計(jì)引物的步驟和注意事項(xiàng),網(wǎng)上太多了,我相信你不是問(wèn)這個(gè),我跟你介紹一下設(shè)計(jì)引物的意義,說(shuō)說(shuō)實(shí)驗(yàn)里的作用吧。
基因都是串在基因組DNA或者載體上的,必須拿下來(lái)才能用,對(duì)吧?怎么拿下來(lái)呢?一般就是用PCR的方法,比如說(shuō)有一串DNA鏈?zhǔn)沁@個(gè)樣子:
---------++++++--------------------------
其中【++++】部分是你要的片段,其它都不要,那就用PCR反復(fù)擴(kuò)增+++部分,最后就得到大量的片段。
可是怎么讓PCR擴(kuò)增的就是+++片段,而沒(méi)有其他---片段呢?就得靠引物——根據(jù)++++片段兩端的幾個(gè)DNA序列,人工合成兩個(gè)20來(lái)個(gè)堿基的短DNA,這段DNA可以和+++片段的兩端互補(bǔ)結(jié)合,就把PCR的范圍限定在兩個(gè)合成的短DNA中間了。
這個(gè)短DNA,就是引物
明白了引物是什么,是干什么用的,你就可以下手了,先在NCBI上查找你的基因的序列,根據(jù)兩頭的DNA序列,設(shè)計(jì)18-22個(gè)配對(duì)的堿基,讓公司去給你合成就行了。
當(dāng)然,其中要注意的問(wèn)題有很多,還涉及酶切位點(diǎn)等,你需要好好看書(shū)。
答:(1) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR(英文全稱:Polymerase Chain Reaction)。
(2)PCR引物設(shè)計(jì)原則
設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡:擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。引物分析軟件將試圖通過(guò)使用每一引物設(shè)計(jì)變化的預(yù)定值在這兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡。設(shè)計(jì)引用有一些需要注意的基本原理:
② 引物長(zhǎng)度
② GC含量,一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%,一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5'端加適量的A、T或G、C尾巴。
③ 退火溫度
退火溫度需要比解鏈溫度低5℃,如果引物堿基數(shù)較少,可以適當(dāng)提高退火溫度,這樣可以使PCR的特異性增加;如果堿基數(shù)較多,那么可以適當(dāng)減低退火溫度,是DNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度相差4℃~6℃不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率,但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的,可以在55℃~75℃間變化。
④ 避免擴(kuò)增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域
選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)目的片段的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu),有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明,待擴(kuò)區(qū)域自由能(△G)小于58.6lkJ/mol時(shí),擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí),用7-deaza-2'-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。
⑤ 與靶DNA的錯(cuò)配
⑥ 引物末端
引物3'端是延伸開(kāi)始的地方,因此要防止錯(cuò)配就從這里開(kāi)始。3'端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反應(yīng)中,引物3′端不能發(fā)生錯(cuò)配。如擴(kuò)增編碼區(qū)域,引物3′端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并,會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。
⑦ 引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu),這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷,引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。兩引物之間不應(yīng)該存在互補(bǔ)性,尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下,一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。
⑧ 為了下一步操作而產(chǎn)生的不完全匹配
5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大,因此,可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括:加酶切位點(diǎn);標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列;引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。額外的堿基或多或少會(huì)影響擴(kuò)增的效率,還加大引物二聚體形成的幾率,但是為了下一步的操作就要作出適當(dāng)?shù)摹盃奚薄?/p>
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