組織培養(yǎng)的方法(組織培養(yǎng)的具體方法是什么)
1.組織培養(yǎng)的具體方法是什么
一、培養(yǎng)基配制 配制培養(yǎng)基有兩種方法可以選擇，一是購買培養(yǎng)基中所有化學藥品，按照需要自己配制；二是購買商品的混合好的培養(yǎng)基基本成分粉劑，如MS、B5等。
自己配制可以節(jié)約費用，但浪費時間、人力、且有時由于藥品的質量問題，給實驗帶來麻煩。就目前國內的情況看，大部分還是自己配制。
為了方便起見，現(xiàn)以MS培養(yǎng)基為例介紹配置培養(yǎng)基的主要過程。 1.配制幾種母液 1.配制MS大量元素母液 一般將大量元素分別配制成100倍的母液，使用時再分別稀釋100倍。
分別稱取 NH4NO3 165g KH2PO4 17g KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g MgSO4·7H2O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
2.配制MS微量元素母液 一般將微量元素配制成100倍母液。 依次稱取 KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g ZnSO4·7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于稱取量很小，如果天平精確度沒有達到萬分之一，可先配成調整液。 分別稱取 CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g 各自配成100ml的調整液，然后取5ml就還有0.0025g的量。
3.配制MS有機母液 一般配制成100倍MS有機母液。 依次稱取 肌醇 10g 鹽酸硫胺素（VB1） 0.01g 煙酸 0.05g 甘氨酸 0.2g 鹽酸吡哆醇（VB6） 0.05g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
4.配制MS鐵鹽母液 一般配制成100倍MS鐵鹽母液。 依次稱取 EDTA二鈉3.73g FeSO4·7H2O2.78g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
所以MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機母液和MS鐵鹽母液，共8種母液。 激素母液的配制 各種生長素和細胞分裂素要單獨配制，不能混合在一起，生長素類一般要先用少量95%的酒精或1當量的NaOH溶解，細胞分裂素一般要先用1當量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。
一般取100mg配成100ml母液。 2.配制培養(yǎng)基 以配置1L MS培養(yǎng)基為例，按順序進行如下操作： 1.先在燒杯中放入一些蒸餾水。
2.分別取上面八種母液10ml倒入。 3.一般稱取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。
4.加蒸餾水用量筒定溶至1L。 5.按設計好的方案添加各種激素，由于激素的用量很小，而且激素對組培植物的生長至關重要。
所以有條件的話最好用微量可調移液器吸取，減少誤差。 6.用精密試紙或酸度計調整PH至5.7-5.8。
（有條件的話使用酸度計，比較精確） 可配1當量的HCL和1當量的NaOH用來調溶液PH值。 1當量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。
1當量NaOH配制：稱取NaOH 4g 配成100ml溶液。 7.稱取5g左右瓊脂粉（質量好的瓊脂粉），倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化。
8.稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)容器中。無蓋的培養(yǎng)容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊。
9.放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右。 10.滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實驗臺上令其冷卻凝固。
二、滅菌 滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學者要清楚有菌和無菌的范疇。
有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點，無菌室等未處理的地方、超凈臺的表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。
這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。菌的特點是：極小，肉眼看不見。
無處不在，無時不有，無孔不入。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。
無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理或化學的滅菌方法處理后的物體（當然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的），高層大氣、巖石內部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內部，強酸強堿，化學元素滅菌劑等表面和內部都是無菌的。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小的多。
滅菌是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質全部殺死。與此相關的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不會完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴格滅菌的操作空間（接種、超凈臺等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。
在這樣的條件下進行的操作，就叫做無菌操作。 植物組織培養(yǎng)對無菌條件的要求是非常嚴格的，甚至超過微生物的培養(yǎng)要求，這是因為培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)，稍不小心就引起雜菌污染。
要達到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對象采取不同的切實有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長。 常用的滅菌方法可分為物。
2.組織培養(yǎng)的步驟
配制培養(yǎng)基有兩種方法可以選擇，一是購買培養(yǎng)基中所有化學藥品，按照需要自己配制；二是購買商品的混合好的培養(yǎng)基基本成分粉劑，如MS、B5等。
自己配制可以節(jié)約費用，但浪費時間、人力、且有時由于藥品的質量問題，給實驗帶來麻煩。就目前國內的情況看，大部分還是自己配制。
為了方便起見，現(xiàn)以MS培養(yǎng)基為例介紹配置培養(yǎng)基的主要過程。1.配制幾種母液1.配制MS大量元素母液一般將大量元素分別配制成100倍的母液，使用時再分別稀釋100倍。
分別稱取NH4NO3 165g KH2PO4 17gKNO3 190g CaCl2·2H2O 44gMgSO4·7H2O 37g各自配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
2.配制MS微量元素母液一般將微量元素配制成100倍母液。依次稱取KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025gH3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025gMnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025gZnSO4·7H2O 0.86g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于稱取量很小，如果天平精確度沒有達到萬分之一，可先配成調整液。分別稱取CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g各自配成100ml的調整液，然后取5ml就還有0.0025g的量。
3.配制MS有機母液一般配制成100倍MS有機母液。依次稱取肌醇 10g 鹽酸硫胺素（VB1） 0.01g煙酸 0.05g 甘氨酸 0.2g鹽酸吡哆醇（VB6） 0.05g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
4.配制MS鐵鹽母液一般配制成100倍MS鐵鹽母液。依次稱取EDTA二鈉3.73g FeSO4·7H2O2.78g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
所以MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機母液和MS鐵鹽母液，共8種母液。激素母液的配制各種生長素和細胞分裂素要單獨配制，不能混合在一起，生長素類一般要先用少量95%的酒精或1當量的NaOH溶解，細胞分裂素一般要先用1當量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。
一般取100mg配成100ml母液。2.配制培養(yǎng)基以配置1L MS培養(yǎng)基為例，按順序進行如下操作：1.先在燒杯中放入一些蒸餾水。
2.分別取上面八種母液10ml倒入。3.一般稱取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。
4.加蒸餾水用量筒定溶至1L。5.按設計好的方案添加各種激素，由于激素的用量很小，而且激素對組培植物的生長至關重要。
所以有條件的話最好用微量可調移液器吸取，減少誤差。6.用精密試紙或酸度計調整PH至5.7~5.8。
（有條件的話使用酸度計，比較精確） 可配1當量的HCL和1當量的NaOH用來調溶液PH值。1當量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。
1當量NaOH配制：稱取NaOH 4g 配成100ml溶液。7.稱取5g左右瓊脂粉（質量好的瓊脂粉），倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化。
8.稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)容器中。無蓋的培養(yǎng)容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊。
9.放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右。10.滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實驗臺上令其冷卻凝固。
滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學者要清楚有菌和無菌的范疇。
有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點，無菌室等未處理的地方、超凈臺的表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。
這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。菌的特點是：極小，肉眼看不見。
無處不在，無時不有，無孔不入。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。
無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理或化學的滅菌方法處理后的物體（當然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的），高層大氣、巖石內部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內部，強酸強堿，化學元素滅菌劑等表面和內部都是無菌的。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小的多。
滅菌是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質全部殺死。與此相關的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不會完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴格滅菌的操作空間（接種、超凈臺等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。
在這樣的條件下進行的操作，就叫做無菌操作。植物組織培養(yǎng)對無菌條件的要求是非常嚴格的，甚至超過微生物的培養(yǎng)要求，這是因為培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)，稍不小心就引起雜菌污染。
要達到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對象采取不同的切實有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長。常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量。
3.組織培養(yǎng)怎么做,求步驟,求方法
要根據(jù)培養(yǎng)目的適當選取材料，選擇原則：易于誘導、帶菌少。
要選取植物組織內部無菌的材料。這一方 面要從健壯的植株上取材料，不要取有傷口的或有病蟲的材料。
另一方面要在晴天，最好是中午或下午取 材料，決不要在雨天、陰天或露水未干時取材料。因為健壯的植株和晴天光合呼吸旺盛的組織，有自身消 毒作用，這種組織一般是無菌的。
培養(yǎng)材料的消毒 從外界或室內選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養(yǎng)基，便會造成 培養(yǎng)基污染。
因此，植物材料必須經(jīng)嚴格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上。第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當?shù)乃⒆拥人⑾础?/p>
把材 料切割成適當大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，沖洗時間視材料 清潔程度而宜。
易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內沖洗。流水沖洗在污染嚴重時特別有用。
洗時可加 入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質性的 物質，便于滅菌液的直接接觸。
當然，最理想的清洗物質是表面活性物質 — 吐溫。第二步是對材料的表面浸潤滅菌。
要在超凈臺或接種箱內完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70% 酒 精、消毒液、無菌水、手表等。用70% 酒精浸10 ~30s 。
由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70% 酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。有一些特殊的材料，如果實、花 蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內部的材料，則可只用70% 酒精處 理稍長的時間。
處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內部材料。第三步是用滅菌劑處理。
表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1 —2 種使用見表。第四步是用無菌 水涮洗，涮洗要每次3min 左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0 次左右。
無菌水涮洗作用是免除消毒劑 殺傷植物細胞的副作用注意：①酒精滲透性強，幼嫩材料易在酒精中失綠，所以浸泡時間要短，防止酒精 殺死植物細胞。②老熟材料，特別是種子等可以在酒精中浸泡時間長一些，如種子可以浸泡5 分鐘。
③升 汞的滲透力弱，一般浸泡10 分鐘左右，對植物材料的殺傷力不大。④漂白粉容易導致植物材料失綠，所 以對于幼嫩材料要慎用。
⑤在消毒液中加入濃度為0.08 —0.12% 的吐溫20 或80 （一種濕潤劑），可以 降低植物材料表面的張力，達到更好的消毒效果。滅菌劑 使用濃度（%） 持續(xù)時間 （ min ） 去除的難易 效 果 次氯酸鈣9~10 5~30 易 很好 次氯酸鈉2 5~30 易 很好 氯化汞0.1~1 5~8 較難 最好 抗菌素4~50mg/L 30~60 中 較好 制備外植體 將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷等，在無菌的環(huán)境下，剝去芽的鱗片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等，葉片則不需剝皮。
在操作中嚴禁用手觸動材料。接種和培養(yǎng) （一）接種 在無菌壞境下，將切好的外植體立即接在培養(yǎng)基上，每瓶接種1 -2 個，以防止交叉污染。
（二）封口 接種后，瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養(yǎng)皿用無菌膠帶封口。（三）溫度 培養(yǎng)基大多應保持在25 ℃左右，但要因花卉種類及材料部位的不同而區(qū)別對待。
增殖 外植體的增殖是組培的關鍵階段，在新梢等形成后為了擴大繁殖系數(shù)，需要繼代培養(yǎng)。把材料分株或切 段轉入增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基一般在分化培養(yǎng)基上加以改良，以利于增殖率的提高。
增殖1 個月左右 后，可視情況進行再增殖。根的誘導 繼代培養(yǎng)形成的不定芽和側芽等一般沒有根，必須轉到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。
1 個月后即可獲得 鍵壯根系。組培苗的煉苗移栽 試管苗從無菌到光、溫、濕穩(wěn)定的環(huán)境進入自然環(huán)境，必須進行煉苗。
一般移植前，先將培養(yǎng)容器打開，于室內自然光照下放3 天，然后取出小苗，用自來水把根系上的營養(yǎng)基沖洗干凈，再 栽入已準備好的基質中，基質使用前最好消毒。移栽前要適當遮蔭，加強水分管理，保持較高的空氣濕度 （相對濕度98 %左右），但基質不宜過濕，以防爛苗。
組織培養(yǎng)中的清洗、消毒滅菌技術 日期：2010 年4 月1 日 來源：互聯(lián)網(wǎng) 作者：植物組培網(wǎng) 點擊：21901 、清洗 植物組織培養(yǎng)用的各種玻璃器皿，特別是培養(yǎng)瓶和盛培養(yǎng)基的器皿，一定要嚴格清洗，以防油污、重金屬離子、酸、堿等有害物質殘留在瓶內，影響培養(yǎng)物的生長。使用過的玻璃器皿應及時清洗，先將污 物如培養(yǎng)基、培養(yǎng)物倒掉，再浸入水中，然后洗滌。
玻璃器皿的洗滌，可根據(jù)器皿的污染程度和性質，采 用不同的方法，通常有堿洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必須先進行高壓消毒和煮沸，以殺死菌 體，否則會產(chǎn)生孢子飛揚，污染環(huán)境，給組織培養(yǎng)帶來嚴重困難。
器皿洗凈后，應烘干或晾干，放在規(guī)定 的地方，便于取用。常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如干熱（ 烘燒和灼燒） 、濕熱（ 常壓或高壓蒸 煮） 、射線處理（ 紫外線、超聲波、微波） 、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法是使用升汞、甲 醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。
4.細胞培養(yǎng)的方法有哪些
細胞培養(yǎng)首先分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng).
原代培養(yǎng)需要從組織中消化、分離、純化出單細胞，然后繼續(xù)進行傳代、凍存；
傳代培養(yǎng)首先：
細胞復蘇：
1.應遵守慢凍快融的原則.先將水溫鍋調至37-38度，取出凍存的細胞迅速放入后交細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化.
2.在無菌臺內將完全培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶內，然后用無菌吸管從凍存管內取出細胞，置培養(yǎng)瓶內輕輕搖晃，使細胞均勻后置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，24h后換液；也可復蘇當時離心（1000rpm 5min左右）后，完全培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)，適時換液.
細胞傳代：
1.貼壁細胞：
對于貼壁細胞應先吸（倒）盡培養(yǎng)基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強度減弱.PBS清洗2-3次，去除血清和死細胞，50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約0.6ml，按此比例進行消化，（根據(jù)配制強度經(jīng)驗），晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2分鐘，鏡下見細胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml完全培養(yǎng)基后，輕輕吹打，使細胞基本成單個懸浮，然后收集離心（1000rpm 5min左右），新鮮培養(yǎng)基重懸沉淀，加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或實驗.
2.懸浮細胞：
一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養(yǎng)瓶內，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如要高濃度或需更換新培養(yǎng)基，可先離心（1000rpm,5min左右）后加入完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻后，分置其它培養(yǎng)瓶內加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).
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5.植物的組織培養(yǎng)包括哪些
（一）按外植體的來源分 外植體：是指在植物組織培養(yǎng)過程中，從植物母體上取來，用于離體培養(yǎng)的初始材料。
（1）植株培養(yǎng) 是指對具有完整植株形態(tài)的幼苗或較大的植株進行離體培養(yǎng)的方法。 （2）胚胎培養(yǎng) 是指對植物成熟或未成熟胚進行離體培養(yǎng)的方法。
常用的胚胎培養(yǎng)材料有幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房。 （3）器官培養(yǎng) 是指對植物體各種器官及器官原基進行離體培養(yǎng)的方法。
常用的器官培養(yǎng)材料有根（根尖，切段）、莖（莖尖、切段）、葉（葉原基、葉片、子葉）、花（花瓣、雄蕊）、果實、種子等。 （4）組織培養(yǎng) 是指對植物體各部位組織或已誘導的愈傷組織進行離體培養(yǎng)的方法。
常用的組織培養(yǎng)材料有分生組織、形成層、表皮、皮層、薄壁細胞、髓部、木質部等。 （5）細胞培養(yǎng) 是指對植物的單個細胞或較小的細胞團進行離體培養(yǎng)的方法。
常用的細胞培養(yǎng)材料有性細胞、葉肉細胞、根尖細胞、韌皮部細胞等。 （6）原生質體培養(yǎng) 是指對除去細胞壁的原生質體進行離體培養(yǎng)的方法。
（二）按培養(yǎng)過程分 （1）初代培養(yǎng) 將植物體上分離下來的外植體進行最初幾代培養(yǎng)的過程。其目的是建立無菌培養(yǎng)物，誘導腋芽或頂芽萌發(fā)，或產(chǎn)生不定芽、愈傷組織、原球莖。
通常是植物組織培養(yǎng)中比較困難的階段，也稱啟動培養(yǎng)、誘導培養(yǎng)。 （2）繼代培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)誘導產(chǎn)生的培養(yǎng)物重新分割，轉移到新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)的過程。
其目的是使培養(yǎng)物得到大量繁殖，也稱為增殖培養(yǎng)。 （3）生根培養(yǎng) 誘導無根組培苗產(chǎn)生根，形成完整植株的過程。
其目的是提高組培苗田間移栽后的成活率。 （三）根據(jù)培養(yǎng)基的類型分為： 1、固體培養(yǎng)： 瓊脂、卡拉膠等固化。
2、半液半固體培養(yǎng)：固液雙層。 3、液體培養(yǎng)：震蕩、旋轉或靜置培養(yǎng)。
（四）根據(jù)再生途徑分為： 1、愈傷組織途徑； 2、芽增殖途徑： 3、原球莖途徑： 4、體胚發(fā)生途徑： 集體的就上植物網(wǎng)。
