薄層色譜的顯色要根據(jù)待分析成分的性質(zhì)來(lái)定,具體分為幾大類:
1、待分析成分本身具有紫外吸收,在紫外光燈下有明顯特殊顏色的熒光。如當(dāng)歸的鑒別,點(diǎn)樣后的薄層色譜板在展開(kāi)后,取出,晾干,置于紫外光燈下(365nm)下檢視。
2、待分析成分顏色不明顯,需要噴顯色劑才可以檢視出斑點(diǎn),還可以置于紫外光燈下檢視。如黃芪的鑒別,薄層色譜板在展開(kāi)后,取出,晾干,10%的硫酸乙醇溶液噴霧后,在105攝氏度加熱約5min,供試品圖譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的棕褐色斑點(diǎn);置紫外光燈(365nm)下檢視,顯相同的橙色斑點(diǎn)。
3、待分析成分的顏色很淺,可以噴顯色劑顯色后,再檢視。如木香的鑒別,薄層色譜板在展開(kāi)后,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,在105攝氏度加熱5min,再檢視。
4、待分析成分的顏色很深,展開(kāi)后晾干,斑點(diǎn)的顏色較明顯,易直接檢視。但這種情況較少。
注:顯色中以上1和3情況應(yīng)用較多。薄層板在展開(kāi)后多需要噴顯色劑,顯色劑的選擇要根據(jù)待分析成分的性質(zhì)來(lái)定,比如生物堿類多用改良碘化鉍鉀做顯色劑,但麻黃堿而又用茚三酮為顯色劑,蒽醌類成分噴稀NaOH做顯色劑等等,在噴顯色劑時(shí)不宜噴得太多,噴得霧滴不要太大,否則斑點(diǎn)顯色不好而不易檢視,多總結(jié)即可在實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)用。另外,紫外光燈下檢視的波長(zhǎng)有254nm和365nm,但一般365nm應(yīng)用較多。
a 光學(xué)檢出法
a自然光(400~800nm)
b紫外光(254nm或365nm)
c熒光一些化合物吸收了較短波長(zhǎng)的光,在瞬間發(fā)射出比照射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光,而在紙或薄層上顯出不同顏色的熒光斑點(diǎn)(靈敏度高、專屬性高)
b 蒸汽顯色法
顯色
多數(shù)有機(jī)化合物吸附碘蒸氣后顯示不同程度的黃褐色斑點(diǎn),這種反應(yīng)有可逆及不可逆兩種情況,前者在離開(kāi)碘蒸氣后,黃褐色斑點(diǎn)逐漸消退,并且不會(huì)改變化合物的性質(zhì),且靈敏度也很高,故是定位時(shí)常用的方法;后者是由于化合物被碘蒸氣氧化、脫氫增強(qiáng)了共軛體系,因此在紫外光下可以發(fā)出強(qiáng)烈而穩(wěn)定的熒光,對(duì)定性及定量都非常有利,但是制備薄層時(shí)要注意被分離的化合物是否改變了原來(lái)的性質(zhì)。
c 物理顯色法
用紫外照射分離后的紙或薄層后,使化合物產(chǎn)生光加成,光分解、光氧化還原及光異構(gòu)等光化學(xué)反應(yīng),導(dǎo)致物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化,如形成熒光發(fā)射功能團(tuán)。發(fā)生熒光增強(qiáng)或淬滅及熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生移動(dòng)等現(xiàn)象,從而提高了分析的靈敏度和選擇性。
d 試劑顯色法
廣泛應(yīng)用的定位方法。用于紙色譜的顯色劑一般都適用于薄層色譜,還有防腐劑的顯色劑不適合用于紙色譜及含有有機(jī)黏合劑薄層的顯色,又時(shí)噴顯色劑后續(xù)加熱,這也不是用于紙色譜。
顯色方法a噴霧顯色:顯色劑溶液以氣溶膠的形式均勻的噴灑在紙和薄層。b 浸漬顯色:揮去展開(kāi)劑的薄層板,垂直的插入盛有展開(kāi)劑的浸漬槽中,設(shè)定浸板及抽出速度和規(guī)定在顯色劑中浸漬的時(shí)間。
顯色試劑
a 通用顯色劑硫酸溶液(硫酸:水 1:1,硫酸:乙醇1:1)、0.5%碘的氯仿溶液、中性0.05%高錳酸鉀溶液、堿性高錳酸鉀溶液(還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色斑點(diǎn))
b 專屬顯色劑
TLC 顯色試劑的選擇 顯色劑可以分成兩大類:一類是檢查一般有機(jī)化合物的通用顯色 劑;另一類是根據(jù)化合物分類或特殊官能團(tuán)設(shè)計(jì)的專屬性顯色劑。
通用顯色劑 硫酸 常用的有四種溶液:硫酸- 水(1:1) 溶液;硫酸- 甲醇或乙醇(1:1) 溶液;1.5mol/L 硫酸溶液與0.5-1.5mol/L 硫酸銨溶液,噴后110 ℃烤15min ,不同有機(jī) 化合物顯不同顏色。0.5 %碘的氯仿溶液 對(duì)很多化合物顯黃棕色。
中性0.05 %高錳酸鉀溶液 易還原性化合物在淡紅背景上顯黃色。堿性高錳酸鉀試劑 還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色。
溶液 I :1% 高錳酸鉀溶液;溶液 II :5% 碳酸鈉溶液;溶液 I 和溶液 II 等量混合應(yīng)用。酸性高錳酸鉀試劑 噴1.6% 高錳酸鉀濃硫酸溶液( 溶解時(shí)注意防止爆炸) ,噴 后薄層于180 o C 加熱15 ~20min 。
酸性重鉻酸鉀試劑 噴5% 重鉻酸鉀濃硫酸溶液,必要時(shí)150 o C 烤薄層。5% 磷鉬酸乙醇溶液噴后120 o C 烘烤,還原性化合物顯藍(lán)色,再用氨氣薰,則背景變 為無(wú)色。
專屬性顯色劑 由于化合物種類繁多,因此專屬性顯色劑也是很多的,現(xiàn)將在各類化合物中 最常用的顯色劑列舉如下:(1) 烴類 ①硝酸銀/ 過(guò)氧化氫 檢出物:鹵代烴類 溶液:硝酸銀0.1g 溶于水1ml ,加2- 苯氧基乙醇 l00ml ,用丙酮稀釋至200ml ,再加30% 過(guò)氧化氫1 滴。方法:噴后置未過(guò)濾的紫外光下照射;結(jié)果:斑點(diǎn)呈暗黑色。
②熒光素/ 溴 檢出物:不飽和烴 溶液:I .熒光素0.1g 溶于乙醇100ml ;II .5% 溴的四氯化碳溶液。方法:先噴(I) ,然后置含溴蒸氣容器內(nèi),熒光素轉(zhuǎn)變?yōu)樗匿鍩晒馑兀?曙紅) ,熒光 消失,不飽和烴斑點(diǎn)由于溴的加成,阻止生成曙紅而保留熒光,多數(shù)不飽和烴在 粉紅色背景上呈黃色。
③四氯鄰苯二甲酸酐 檢出物:芳香烴 溶液:2 %四氯鄰苯二甲酸酐的丙酮與氯代苯(10:1) 的溶液。方法:噴后置紫外光下觀察。
④甲醛/ 硫酸 檢出物:多環(huán)芳烴 溶液:37% 甲醛溶液0.2ml 溶于濃硫酸 l0ml 。(2) 醇類3,5- 二硝基苯酰氯 檢出物:醇類 溶液:I .2% 本品甲苯溶液;II .0.5% 氫氧化鈉溶液;III .0.002% 羅丹明溶液。
方 法:先噴(I) ,在空氣中干燥過(guò)夜,用蒸氣薰2min ,將紙或薄層通過(guò)試液(II)30s ,噴水洗,趁濕通過(guò)(III)15s ,空氣干燥,紫外燈下觀察。硝酸鈰銨 檢出物:醇類 溶液:I .1% 硝酸鈰銨的0.2mol/L 硝酸溶液;II . N,N- 二甲基- 對(duì)苯二胺鹽酸鹽1.5g 溶于甲醇、水與乙酸(128ml+25ml+1.5ml) 混合液中,用前將(I) 與(II) 等量混合。
噴板后于105 o C 加熱5min 。
薄層色譜的顯色要根據(jù)待分析成分的性質(zhì)來(lái)定,具體分為幾大類:1、待分析成分本身具有紫外吸收,在紫外光燈下有明顯特殊顏色的熒光。
如當(dāng)歸的鑒別,點(diǎn)樣后的薄層色譜板在展開(kāi)后,取出,晾干,置于紫外光燈下(365nm)下檢視。2、待分析成分顏色不明顯,需要噴顯色劑才可以檢視出斑點(diǎn),還可以置于紫外光燈下檢視。
如黃芪的鑒別,薄層色譜板在展開(kāi)后,取出,晾干,10%的硫酸乙醇溶液噴霧后,在105攝氏度加熱約5min,供試品圖譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的棕褐色斑點(diǎn);置紫外光燈(365nm)下檢視,顯相同的橙色斑點(diǎn)。3、待分析成分的顏色很淺,可以噴顯色劑顯色后,再檢視。
如木香的鑒別,薄層色譜板在展開(kāi)后,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,在105攝氏度加熱5min,再檢視。4、待分析成分的顏色很深,展開(kāi)后晾干,斑點(diǎn)的顏色較明顯,易直接檢視。
但這種情況較少。注:顯色中以上1和3情況應(yīng)用較多。
薄層板在展開(kāi)后多需要噴顯色劑,顯色劑的選擇要根據(jù)待分析成分的性質(zhì)來(lái)定,比如生物堿類多用改良碘化鉍鉀做顯色劑,但麻黃堿而又用茚三酮為顯色劑,蒽醌類成分噴稀NaOH做顯色劑等等,在噴顯色劑時(shí)不宜噴得太多,噴得霧滴不要太大,否則斑點(diǎn)顯色不好而不易檢視,多總結(jié)即可在實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)用。另外,紫外光燈下檢視的波長(zhǎng)有254nm和365nm,但一般365nm應(yīng)用較多。
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